המרת ביסולפיט של DNA גנומי: שיטה לחקר מתילציה של DNA בדגימות DNA גנומיות מרקמת סרטן מערכת העיכול

0 צפיות4:36 דק' • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתילציה של DNA כוללת תוספת של קבוצת מתיל לשאריות ציטוזין של DNA ליצירת מתיל-ציטוזין, מה שגורם לשינוי DNA ולוויסות ביטוי גנים.

כדי לחקור מתילציה של DNA, התחל בנטילת תמצית DNA גולמית מתאים סרטניים. מוסיפים מאגר דילול ודוגרים בטמפרטורת החדר. המאגר מדלל את התערובת ומפרק את ה-DNA הדו-גדילי ל-DNA חד-גדילי, ומעדיף את הנגישות של בסיסים לתגובות הבאות.

הוסף מגיב המרה ודגר בחושך. נתרן ביסולפיט במגיב מפעיל את הסולפונציה ואת הפירוק שלאחר מכן של שאריות ציטוזין לא מתיליות, וכתוצאה מכך היווצרות אורציל-סולפונט. עם זאת, שאריות ציטוזין מתילציה נותרות ללא שינוי.

לאחר מכן, השלם את ה-DNA עם מאגר מחייב והעביר אותו לעמודת מסנן ספין שהורכבה מראש. המאגר עוזר ל-DNA להיקשר למסנן.

צנטריפוגה להסרת תערובת המאגר והמגיב הביסולפיט מה-DNA הכלוא בעמודה. השליכו את הזרימה. הוסף מאגר הסרת סולפונציה אלקליין ל- DNA. המאגר מסייע בהסרת קבוצת סולפיט מאורציל-סולפונאט ליצירת אורציל.

צנטריפוגה להסרת המאגר המשומש. כעת, הוסף מאגר פליטה לעמודה כדי להוציא את ה-DNA שהומר. בצע PCR כדי להגביר את ה-DNA. כל שאריות האורציל שהומרו מתגברות כתימינים, בעוד שאריות הציטוזין המתיליאטיות מתגברות כציטוזינים.

רצף שאריות ציטוזין של ה-DNA המוגבר ליצירת פרופיל מתילציה של הדגימה.

יש לבצע את הטיפול בביסולפיט על 45 מיקרוליטר מהרקמה המעוכלת באמצעות ערכת המרה של ביסולפיט בהתאם להוראות היצרן. הוסף לדגימה 5 מיקרוליטר של מאגר דילול ודגר אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. בינתיים, הכינו את מגיב ההמרה של ביסולפיט על ידי הוספת 750 מיקרוליטר מים מזוקקים ו-210 מיקרוליטר של מאגר דילול לצינור אחד של מגיב המרת CT. מערבבים את הצינורות על ידי מערבולת למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב המרת ה-CT המוכן לכל דגימה וערבב בהיפוך.

דגרו את הדגימות בחושך בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. לאחר הדגירה, הניחו את הדגימות על קרח למשך 10 דקות. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב וערבב כל דגימה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. טען כל דגימה לעמודת ספין והנח את העמודה בצינור איסוף של 2 מיליליטר. צנטריפוגה את הדגימות במלוא המהירות למשך דקה אחת והשליכו את הזרימה דרכם. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל עמודה וסובב במלוא המהירות למשך דקה אחת, ולאחר מכן השליך את הזרימה.

הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר הסרת סולפונציה לכל עמודה ואפשר לעמודים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, סובבו את העמודים במלוא המהירות למשך דקה אחת והשליכו את הזרימה. שוטפים את העמוד פעמיים עם 200 מיקרוליטר מאגר כביסה, צנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות מלאה לאחר כל כביסה.

הוסף 46 מיקרוליטר מים מזוקקים לכל עמוד והנח אותו בצינור פוליפרופילן חד פעמי סטרילי חדש בנפח 1.5 מיליליטר. סובב את הצינורות במשך 2 דקות כדי לחמוק את ה-DNA ולהשליך את העמודה. ה-DNA מוכן כעת לניתוח. השתמש ב-DNA ששונה בביסולפיט כתבנית ל-PCR כמותי ספציפי למתילציה כדי להעריך מתילציה של אזור המקדם בכל ניתוח גנים. שלב את הריאגנטים כמתואר בכתב היד של הטקסט, והשתמש במכשיר PCR בזמן אמת של 96 בארות כדי להפעיל את פרוטוקול הרכיבה התרמית.

11:19

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

סרטונים קשורים

0 צפיות

13:21

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

סרטונים קשורים

0 צפיות

12:18

קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצ'אל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות

סרטונים קשורים

0 צפיות

12:34

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

סרטונים קשורים

0 צפיות

13:11

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ"א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

סרטונים קשורים

0 צפיות

13:18

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

סרטונים קשורים

0 צפיות

13:47

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

סרטונים קשורים

0 צפיות

08:38

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

סרטונים קשורים

0 צפיות

08:40

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

סרטונים קשורים

0 צפיות

12:11

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

סרטונים קשורים

0 צפיות

עודכן לאחרונה: 1 אוגוסט 2026