אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 4:00 דק׳ • April 30th, 2023
צביעת סיבים אלסטיים מסייעת לבחון פלישת תאים סרטניים מעבר ללמינה האלסטית הצפק או הרקמה האלסטית התת-מזותלית.
כדי להתחיל, הוסף תמיסת אשלגן פרמנגנט לקטע רקמה מעובדת, ואחריו טבילה בחומצה אוקסלית. תכונת החמצון החזקה של שילוב אשלגן פרמנגנט-חומצה אוקסלית מלבינה את הפיגמנט הטבעי מקטע הרקמה כדי למנוע הפרעה לתהליך הצביעה על ידי טשטוש מורפולוגיה של סיבים אלסטיים.
שטפו את השקופית במים ואתנול כדי להסיר שאריות של חומר הלבנה. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בכתם אלסטין המורכב מקומפלקס ברזל-המטוקסילין. לאלסטין, מרכיב הסיבים האלסטיים העיקרי, יש זיקה חזקה למתחמי ברזל-המטוקסילין.
שטפו את השקופית באתנול ומים כדי להסיר כל כתם שנותר. לבסוף, טפל בדגימה עם כתם נגדי המכיל חומצה פיקרית ופונסו S. מולקולות החומצה הפיקרית הקטנות יותר חודרות לכל סוגי הרקמות אך נשמרות היטב על ידי תאי השריר ותאי הסרטן בעלי המרקם הקרוב. לעומת זאת, מולקולות Ponceau S הגדולות יותר מחליפות חומצה פיקרית בקולגן בעל המרקם הנקבובי, מה שגורם לקולגן להיות צבוע באופן שונה מתאי השריר והסרטן.
כאשר הם נצפים במיקרוסקופ, סיבים אלסטיים מופיעים כחוטים כחולים-שחורים. קולגן מכתים באדום, בעוד שתאי שריר ותאי סרטן נראים צהובים. תאי סרטן צהובים החודרים ללמינה האלסטית הכחולה-שחורה מאשרים פלישה גרורתית.
ראשית, השתמש בנייר טישו כדי לנגב כל תמיסה עודפת על השקופית או סביב הממחטה. הנח את המגלשות בתנאים התואמים את טמפרטורת החדר והלחות. הוסף כמה טיפות אשלגן פרמנגנט לכל שקופית כדי לחמצן אותן, וודא שהנפח שנוסף מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה בכל שקופית. לאחר 5 דקות, שטפו את השקופיות המחומצנות במים מזוקקים בצנצנות קופלין, חזרו על השטיפה פעמיים-שלוש והשתמשו בצנצנת מים חדשה לכל שטיפה. הרקמה צריכה להיות בעלת צבע חום שניתן לראות.
כעת, הוסף כמה טיפות של חומצה אוקסלית לכל שקופית כדי להלבין אותן, וודא שהנפח שנוסף מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה בכל שקופית. לאחר 5 דקות יש לשטוף את מגלשות האקונומיקה במים מזוקקים, לחזור על השטיפה פעמיים-שלוש ולהשתמש בצנצנת מים חדשה לכל שטיפה. שוטפים את השקופיות לזמן קצר ב 95% אלכוהול.
טבלו את השקופיות השטופות בתמיסת אלסטין למשך 8 עד 24 שעות. לאחר מכן, טבלו את השקופיות ישירות באתנול 95% למשך 1 עד 2 דקות כדי להבדיל היטב בין כל קטע רקמה. שוטפים את השקופיות לחלוטין במים מזוקקים.
בדוק במיקרוסקופ אם הסיבים האלסטיים הכחולים-שחורים מכתימים והרקע האפור. עדיף להבדיל מעט את הרקמה מכיוון שכתם הנגד של ואן גיסון שלאחר מכן יכול גם לחלץ במידת מה את הכתם האלסטי.
כתם את השקופיות בתמיסת ואן גיסון למשך דקה אחת, וודא שהנפח המשמש מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה בכל שקופית לחלוטין. לאחר מכן, זרוק במהירות 95% אתנול על פרוסות הרקמה למשך מספר שניות כדי להבדיל היטב בין כל חלק רקמה.