מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים או NETs: טכניקה לניתוח אינטראקציה לאחר הידבקות בין תאים סרטניים ו- NETs

במצבים פתולוגיים כמו סרטן, נויטרופילים מופעלים משחררים מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים או NETs - רשת של סיבי DNA חוץ-תאיים הקשורים להיסטונים ואנזימים פרוטאוליטיים. מבנים אלה לוכדים תאים סרטניים וממלאים תפקיד מפתח בגרורות סרטניות.

כדי לחקור את ההתנהגות שלאחר ההדבקה של תאים סרטניים כלואים ב-NETs במבחנה, ראשית, תרבית נויטרופילים בצפיפות נמוכה - תת-אוכלוסיית נויטרופילים - בצלחת תרבית מצופה פולימר המאפשרת חיבור תאים. דגירה כדי להפעיל את הנויטרופילים כדי לשחרר NETs דמויי רשת.

לאחר מכן, הוסף צבע גרעיני פלואורסצנטי ירוק אטום לממברנה כדי להכתים את סיבי ה-DNA ב-NETs באופן ספציפי. הסר את המדיום המושקע. הוסף תרחיף של תאים סרטניים לתרבית הנויטרופילים.

דגרו על התרבית לתקופה קצרה כדי להקל על אינטראקציה בין תאים סרטניים ל-NET. מרכיב ה-DNA של NETs מתפקד כגורם כימו-טקטי הממריץ את נדידת התאים הסרטניים ומסייע בהדבקתם ל-NETs.

הסר את המדיום המושקע. שטפו בעדינות את התרבית במדיה טרייה מתאימה כדי להסיר תאי סרטן לא קשורים מכלי התרבית. יש לחדש את המלאי בחומר טרי המכיל סרום.

דמיין את התרבית למשך זמן ממושך באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse כדי לנתח את האירועים האינטראקטיביים בין NETs לתאים סרטניים. עם הזמן, ה-NETs מספקים מיקרו-סביבה מתאימה המאפשרת התפשטות של תאים סרטניים. השתמש בתוכנה מתאימה כדי לצפות בהתפשטות תאים סרטניים ב-NETs פלואורסצנטיים ירוקים.

תרבית וצביעה של הנויטרופילים הצפק בצפיפות נמוכה בצלחת של 35 מילימטר, צלחת מצופה פולי-L-ליזין כפי שהודגם, ולאחר מכן שטיפה קצרה ב-2 מיליליטר של 0.1% BSA בתוספת RPMI 1640.

החלף את המדיום ב-1 כפול 10 עד השישי תאי גידול קיבה לא מוכתמים תלויים ב-2 מיליליטר RPMI בתוספת BSA לדגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב-2 מיליליטר של RPMI טרי בתוספת BSA למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מערבולת עדינה להסרת תאי גידול לא מחוברים.

לאחר מכן, החלף את הסופרנטנט ב-DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה והרכיב את הצלחת במערכת תצפית תאים מלאה לניתוח זמן-lapse של לכידת תאי הגידול על ידי ה-NETs.