הכנת בלוק אקסוזום: פרוטוקול לשימור אקסוזומים מתאי סרטן המעי הגס האנושיים בתרבית

אקסוזומים הם המבנים השלפוחיתיים החוץ-תאיים המופרשים על ידי תאים מתורבתים לתוך הסופרנטנט. כדי להכין בלוק אקסוזום, התחל בלקיחת תרבית המכילה אקסוזום בשפופרת. צנטריפוגה את הצינור במהירות גבוהה כדי לגלול את האקסוזומים השלמים. השליכו את הסופרנטנט שנותר.

טפל בכדור האקסוזום עם גלוטרלדהיד הקיים במאגר הקיבוע. דגרו את התערובת על קרח למשך הזמן הרצוי כדי לשמר את המורפולוגיה של האקסוזומים. גלוטראלדהיד חודר לאקסוזומים ומקשר בין החלבונים. מאגר קיבוע שומר על אקסוזומים ב-pH ניטרלי לתהליך הקיבוע במורד הזרם.

השליכו את המאגר המכיל גלוטראלדהיד והוסיפו תמיסת אוסמיום טטרוקסיד - קיבוע משני המחלחל לשכבת הממברנה הדו-שכבתית ומקבע את השומנים הקיימים באקסוזומים. הסר את תמיסת האוסמיום טטרוקסיד וטפל באקסוזומים בסדרה של ריכוזים הולכים וגדלים של אצטון. תהליך זה מייבש את האקסוזומים.

החלף אצטון מוחלט בתערובת האצטון הבינונית המוטמעת. בהדרגה, הגדל את יחס מדיום ההטמעה בתערובת זו.

יוצקים את תערובת ההטמעה המכילה אקסוזומים לתבניות הרצויות. מייבשים את התבניות בתנור בטמפרטורה גבוהה. זה יוביל לפילמור של מדיום ההטבעה סביב האקסוזומים, מה שיוליד בלוקים.

כדי לתקן את גלולת האקסוזום המטוהרת, הוסף 1 מיליליטר של 2.5% גלוטראלדהיד בתמיסת נתרן קקודילאט של 0.1 M ב-pH 7.0. דגרו את השלפוחיות הדו-שכבתיות של השומנים למשך שעה בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הקיבוע ושטוף את הכדורים עם 1 מיליליטר של תמיסת חיץ נתרן קקודילאט 0.1 M בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן, לאחר מכן תקן את הדגימות עם 1 מיליליטר של 2% אוסמיום טטרוקסיד למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הקיבוע ושטוף את כדור האקסוזום שלוש פעמים עם מאגר הנתרן קקודילאט 0.1 M, והחלף את המאגר כל 10 דקות. לאחר מכן, ייבשו את הדגימה על ידי ניעור במשך 10 דקות כל אחת בסדרה של ריכוזי אצטון מדורגים.

לאחר מכן, מערבבים תמיסה של שלושה חלקים אצטון וחלק אחד של תערובת הטבעה עם צמיגות נמוכה. החלף את האצטון בתערובת זו ודגר את הדגימה למשך 30 דקות. המשך להגדיל את היחס של מדיום ההטמעה של צמיגות נמוכה, תוך דגירה למשך 30 דקות בכל שלב.

לבסוף, דגרו את גלולת האקסוזום ב-100% מתערובת ההטמעה של צמיגות נמוכה למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, הטמיעו את הדגימה בתערובת הטמעה טהורה עם צמיגות נמוכה באמצעות תבנית הטבעה ואפו אותה במשך 24 שעות בחום של 65 מעלות צלזיוס.