הכנת בלוק אקסוזום: פרוטוקול לשימור אקסוזומים מתאי סרטן המעי הגס האנושיים בתרבית

אקסוזומים הם המבנים השלפוחיתיים החוץ-תאיים המופרשים על ידי תאים מתורבתים לתוך הסופרנטנט. כדי להכין בלוק אקסוזום, התחל בלקיחת תרבית המכילה אקסוזום בשפופרת. צנטריפוגה את הצינור במהירות גבוהה כדי לגלול את האקסוזומים השלמים. השליכו את הסופרנטנט שנותר.

טפל בכדור האקסוזום עם גלוטרלדהיד הקיים במאגר הקיבוע. דגרו את התערובת על קרח למשך הזמן הרצוי כדי לשמר את המורפולוגיה של האקסוזומים. גלוטראלדהיד חודר לאקסוזומים ומקשר בין החלבונים. מאגר קיבוע שומר על אקסוזומים ב-pH ניטרלי לתהליך הקיבוע במורד הזרם.

השליכו את המאגר המכיל גלוטראלדהיד והוסיפו תמיסת אוסמיום טטרוקסיד - קיבוע משני המחלחל לשכבת הממברנה הדו-שכבתית ומקבע את השומנים הקיימים באקסוזומים. הסר את תמיסת האוסמיום טטרוקסיד וטפל באקסוזומים בסדרה של ריכוזים הולכים וגדלים של אצטון. תהליך זה מייבש את האקסוזומים.

החלף אצטון מוחלט בתערובת האצטון הבינונית המוטמעת. בהדרגה, הגדל את יחס מדיום ההטמעה בתערובת זו.

יוצקים את תערובת ההטמעה המכילה אקסוזומים לתבניות הרצויות. מייבשים את התבניות בתנור בטמפרטורה גבוהה. זה יוביל לפילמור של מדיום ההטבעה סביב האקסוזומים, מה שיוליד בלוקים.

כדי לתקן את גלולת האקסוזום המטוהרת, הוסף 1 מיליליטר של 2.5% גלוטראלדהיד בתמיסת נתרן קקודילאט של 0.1 M ב-pH 7.0. דגרו את השלפוחיות הדו-שכבתיות של השומנים למשך שעה בחום של 4 מעלות