חיתוך, צביעה והדמיית TEM של אקסוזומים משובצים: פרוטוקול להמחשת התכונות המבניות של אקסוזומים באמצעות TEM

אקסוזומים הם שלפוחיות כדוריות בגודל ננומטרי המוקפות בשכבת שומנים דו-שכבתית המכילה DNA, RNA ומולקולות חלבון הקיימות בתוך הלומן.

כדי לדמיין את מבנה האקסוזום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, או TEM, התחל בלקיחת בלוק אקסוזום - בלוק מטריצה מוצק המכיל את האקסוזומים המוטבעים. בעזרת מיקרוטום אולטרה-מיקרוטום, השג חלקים דקים במיוחד של גוש האקסוזום.

אוספים את החלק האקסוזומי על רשת מתאימה ומאפשרים לו להיצמד למשטח. הרשת מספקת תמיכה יציבה לדגימת האקסוזום לשלבי הצביעה הבאים.

לאחר מכן, מקם את הרשת מעל טיפת אורניל אצטט - כתם מתכת כבד - ודגר למשך הזמן הרצוי. יוני אורניל מקיימים אינטראקציה עם שומנים, חלבונים, DNA ו-RNA הנמצאים באקסוזומים.

לאחר מכן, יש לצבוע את החלק האקסוזומי בציטראט עופרת, שנקשר גם לביו-מולקולות האקסוזומליות. ציטראט עופרת נקשר חלש ליוני האורניל הקשורים מראש ומשפר את הניגודיות כנגד הרקע במהלך ההדמיה.

התבונן באקסוזומים המוכתמים כפולים באמצעות TEM. TEM ממקד את אלומת האלקטרונים על דגימת האקסוזום. אזורים מוכתמים באקסוזום מפזרים אלקטרונים חזק יותר בהשוואה לאזורים הלא מוכתמים.

צמצם המטרה מסנן את האלקטרונים המפוזרים הללו. לפיכך, אקסוזומים המכילים ביומולקולות מוכתמות נראים כהים יותר מהרקע.

בעזרת אולטרה-מיקרוטום, הכינו קטעים בעובי של 60 ננומטר. מניחים את החלקים על רשת ניקל ומכתימים את חלקם פעמיים באורניל אצטט 2% למשך 20 דקות, ולאחר מכן ציטראט עופרת למשך 10 דקות. לאחר מכן, הנח את החלק המוכתם במיקרוסקופ אלקטרונים שידור וצפה בדגימה באמצעות 80 קילו וולט ופעל לפי ההגדרות האוטומטיות לזמן החשיפה. עם תמונה אקסוזומית בתצוגה, רכוש ושמור את התמונה באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.