זהב immunostaining של חתכים אקסוזומליים: טכניקה כדי לדמיין סמנים אבחון לומן אקסוזומלי
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:36 דק׳ • April 30th, 2023
אקסוזומים הם שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות הסוגרות מגוון ביומולקולות המשמשות כסמנים ביולוגיים לסרטן.
כדי להמחיש סמנים ביולוגיים אקסוזומיים, התחל עם מקטעים אקסוזומיים משובצים בשרף דק במיוחד הנתמכים ברשתות מתכת מתאימות של מיקרוסקופ אלקטרונים. דגרו את הרשתות בטיפות גליצין. גליצין קושר ומנטרל קבוצות אלדהיד תגובתיות בקטעים כדי להתגבר על הפרעתם לבדיקה.
שטפו את הדגימה במים כדי להסיר ריאגנטים שנותרו. לאחר מכן, דגרו את הדגימה במאגר חוסם. המאגר נושא חלבוני סרום החוסמים אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים בדגימה.
לאחר מכן, דגרו את הדגימה בתמיסת הנוגדנים הראשונית הרצויה. נוגדנים אלה מזהים ונקשרים לסמנים הביולוגיים שלהם הממוקמים בלומן האקסוזומי. שטפו את כל הנוגדנים הלא קשורים עם מאגר מתאים.
כעת, העבירו את הרשתות נושאות הדגימה לטיפות המכילות נוגדנים משניים מצומדים לזהב הנצמדים לנוגדנים הראשוניים. ננו-חלקיקי הזהב משמשים כסמנים צפופי אלקטרונים כדי להמחיש את הלוקליזציה העדינה של מולקולות המטרה. שטפו את כל הנוגדנים המשניים הלא קשורים עם מאגר מתאים.
לבסוף, בתנאים חשוכים, דגרו את הרשתות ברצף בתמיסות אורניל אצטט וציטראט עופרת. ריאגנטים אלה של מתכות כבדות מכתימים ומשפרים את הניגודיות של מולקולות אורגניות כמו שומנים, חלבונים וגליקוגנים בדגימה, ומבדילים אותם מהרקע.
התבונן בחלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שיד
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים