צביעה שלילית של אקסוזומים מטוהרים: הליך להמחשת מורפולוגיה אקסוזום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

כדי לבצע צביעה שלילית של אקסוזומים - שלפוחיות כדוריות בגודל ננומטרי - התחל בלקיחת רשת מיקרוסקופ אלקטרונים מתאימה. הכינו את הרשת באמצעות מפרק זוהר. תהליך זה הופך את פני הרשת להידרופילים להדבקה טובה יותר של דגימות.

במקביל, קח השעיה של אקסוזומים מטוהרים בצינור. השלימו את הצינור עם פרפורמלדהיד - מקבע לדוגמא - ודגרו. פרפורמלדהיד חודר לאקסוזומים ומקשר בין החלבונים וחומצות הגרעין. שלב זה חיוני לשימור המורפולוגיה של האקסוזומים.

כעת, טען את מתלה האקסוזום על הרשת שהוכנה מראש ודגר כדי לאפשר ספיחה. לאחר מכן, הוסיפו כמה טיפות של אורניל אצטט, כתם מתכת כבד, מעל הרשת. יוני אורניל נקשרים לחלבוני הממברנה ולליפידים ויוצרים משקע סביב גבול האקסוזום.

לבסוף, שטפו את הרשת במים כדי להסיר את הכתם העודף. אפשר לרשת להתייבש ולצלם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור או TEM.

כאשר קרן אלקטרונים פוגעת באקסוזומים, הכתם המקיף את הדגימה מפזר יותר אלקטרונים. אקסוזומים בהיותם פחות צפופים באלקטרונים, מאפשרים לקרן לעבור דרכם. אלקטרונים מפוזרים שונים אלה נלכדים על ידי מערכת ההדמיה ליצירת תמונה בעלת ניגודיות גבוהה.

אקסוזומים מוכתמים שלילית נראים בהירים יותר, עם גבול כהה סביבם.

על מנת לבצע צביעה שלילית, יש לתקן את האקסוזומים המטוהרים לאחר הבידוד עם 1 מיליליטר של 2% פרפורמלדהיד למשך 5 דקות. טפל בפורמבר דק / סרט פחמן מצופה 200