אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:10 דק׳ • April 30th, 2023
כדי לבצע צביעה שלילית של אקסוזומים - שלפוחיות כדוריות בגודל ננומטרי - התחל בלקיחת רשת מיקרוסקופ אלקטרונים מתאימה. הכינו את הרשת באמצעות מפרק זוהר. תהליך זה הופך את פני הרשת להידרופילים להדבקה טובה יותר של דגימות.
במקביל, קח השעיה של אקסוזומים מטוהרים בצינור. השלימו את הצינור עם פרפורמלדהיד - מקבע לדוגמא - ודגרו. פרפורמלדהיד חודר לאקסוזומים ומקשר בין החלבונים וחומצות הגרעין. שלב זה חיוני לשימור המורפולוגיה של האקסוזומים.
כעת, טען את מתלה האקסוזום על הרשת שהוכנה מראש ודגר כדי לאפשר ספיחה. לאחר מכן, הוסיפו כמה טיפות של אורניל אצטט, כתם מתכת כבד, מעל הרשת. יוני אורניל נקשרים לחלבוני הממברנה ולליפידים ויוצרים משקע סביב גבול האקסוזום.
לבסוף, שטפו את הרשת במים כדי להסיר את הכתם העודף. אפשר לרשת להתייבש ולצלם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור או TEM.
כאשר קרן אלקטרונים פוגעת באקסוזומים, הכתם המקיף את הדגימה מפזר יותר אלקטרונים. אקסוזומים בהיותם פחות צפופים באלקטרונים, מאפשרים לקרן לעבור דרכם. אלקטרונים מפוזרים שונים אלה נלכדים על ידי מערכת ההדמיה ליצירת תמונה בעלת ניגודיות גבוהה.
אקסוזומים מוכתמים שלילית נראים בהירים יותר, עם גבול כהה סביבם.
על מנת לבצע צביעה שלילית, יש לתקן את האקסוזומים המטוהרים לאחר הבידוד עם 1 מיליליטר של 2% פרפורמלדהיד למשך 5 דקות. טפל בפורמבר דק / סרט פחמן מצופה 200 רשתות נחושת EM עם פריקת זוהר למשך דקה אחת. לאחר מכן, טען 5 עד 7 מיקרוליטר מתמיסת המתלה האקסוזומית על רשת ודגר אותה למשך דקה. אם ריכוז האקסוזום גבוה מדי, יש לדלל את הריכוז לרמה מתאימה.
מיד, צבעו את האקסוזומים בכ-20 טיפות של תמיסת אורניל אצטט מסוננת 1% על פני רשת ה-EM. הסר את תמיסת האורניל אצטט העודפת מהרשת על ידי מגע עם קצה הרשת עם נייר סינון. לאחר מכן, שטפו במהירות את הרשת בטיפת מים.
השתמש בזוג פינצטה כדי להניח את הרשת על השולחן, וכסה את הרשת חלקית בצלחת תרבית. הניחו לרשת להתייבש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צלמו את הרשת או אחסנו אותה בקופסת רשת מיקרוסקופ אלקטרונים לתצפית עתידית.