Lamina Propria בידוד תאים חד-גרעיניים: טכניקת צנטריפוגה הדרגתית מבוססת סיליקה להשגת תאים חד-גרעיניים מהמעי הגס של מורין

למינה פרופריה במעי, הממוקמת מתחת לאפיתל המעי, מורכבת מרקמת חיבור רופפת יחד עם רשת צפופה של סיבי קולגן המכילה מגוון רחב של תאים כגון פיברובלסטים, תאים חד-גרעיניים, כולל לימפוציטים ומונוציטים. תאים אלה ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס.

כדי לבודד תאים חד-גרעיניים, התחל בלקיחת שברי מעי גס של עכבר. טפל בשברים בעזרת מאגר עיכול המכיל אנזימי קולגנאז. אנזימי קולגנאז מעכלים את סיבי הקולגן בתוך הרקמה, ומשחררים את התאים לתרחיף.

אספו את הסופרנטנט וסננו אותו דרך מסננות תאים כדי להסיר רקמות ופסולת לא מעוכלות ולקבל תרחיף של תא בודד. הוסף חוצץ צונן לתסנין כדי לנטרל את אנזימי הקולגנאז.

צנטריפוגה להפרדת התאים. השליכו את הסופרנטנט המכיל את האנזימים והשעו מחדש את גלולת התא באמצעי הפרדה מבוסס סיליקה בצפיפות נמוכה. לאחר מכן, שכבו את המתלה על אמצעי הפרדה מבוסס סיליקה בצפיפות גבוהה כדי ליצור שיפוע הפרדה.

צנטריפוגה את התערובת. התאים החד-גרעיניים משקעים ויוצרים שכבה לבנה בממשק בין שכבות שיפוע הצפיפות. העבירו בזהירות את שכבת הממשק הלבנה לתוך צינור טרי המכיל מאגר מתאים.

צנטריפוגה להשגת גלולה המכילה תאים חד-גרעיניים מטוהרים. השהה מחדש את הגלולה במאגר להמשך ניתוח במורד הזרם.

כדי להתחיל, הוסף 20 מיליליטר של מאגר עיכול קולגנאז לצינור המכיל את שברי המעי הגס השטופים. אטמו את הצינור והניחו אותו בשייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם קצב סיבוב של 2 x גרם למשך 60 דקות. ודא ששברי הרקמה נמצאים בתנועה מתמדת במהלך התסיסה.

יוצקים 5 מיליליטר של אמצעי הפרדת צפיפות מבוססי סיליקה של 66% לכל אחד משלושה צינורות פוליפרופילן נפרדים של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר כדי לאסוף רק את הסופרנטנט מעיכול קולגנאז 1. סנן את הסופרנטנט דרך מסננת תאי בד סינון של 40 מיקרוליטר נקבוביות המונחת לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן נקי של 50 מיליליטר. מלאו את השפופרת לחלוטין במאגר המעי הגס המצונן, כדי להרוות את מאגר העיכול של הקולגנאז. לאחר מכן, סובבו את התאים, שאפו את הסופרנטנט ושמרו את הכדור על קרח.

המשך לבצע עיכול קולגנאז 2 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר השלמת עיכול קולגנאז 2, שטפו את שברי הרקמה במרץ קדימה ואחורה בין הצינור למזרק של 10 מיליליטר דרך מחט קהה של 18G. חזור על שטיפה זו במשך שבעה עד שמונה מעברים, והמשך עד שלא נראים שברי רקמה גסה או פסולת.

לאחר מכן, העבירו את תרחיף פירוק הרקמות דרך מסננת תאי בד סינון של 40 מיקרומטר המונחת לתוך צינור פוליפרופילן נקי של 50 מיליליטר. מלאו את הצינור עד השפה במאגר מעי גס צונן כדי להרוות את העיכול והצנטריפוגה בחום של 800 x גרם ובטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.

השליכו את הסופרנטנט באמצעות שאיבת ואקום ומשכו את הכדור התלוי מעיכול קולגנאז 1 לצינור המתאים לו. לאחר מכן, יש להשהות מחדש כל גלולה ב-24 מיליליטר של 44% מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה לכל מעי גס. השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להניח לאט 8 מיליליטר של מדיה זו על כל אחד משלושת הצינורות המכילים 66% מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה.

אזנו בזהירות את הצינורות בתוך דליי צנטריפוגה באמצעות משקל או איזון. צנטריפוגה ב-859 x גרם וב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ללא הפסקה. אפשר לרוטורים להגיע למנוחה מוחלטת לפני הסרת הצינורות, תוך הקפדה לא לשבש את התאים בממשק השיפוע.

דמיין את ממשק השיפוע ליד הסימון של 5 מיליליטר שבו בדרך כלל קיים פס לבן בעובי 1-2 מילימטר. שואב אבק והשליך את 7 המיליליטר העליונים של השיפוע כדי לאפשר גישה קלה יותר לפיפטה לממשק. באמצעות יניקה ידנית רציפה ותנועה מסתובבת קבועה של שורש כף היד, אסוף את שכבת הממשק של התאים. אסוף עד שהממשק בין שני השיפועים יהיה ברור ושביר, והעביר את הממשק לצינור חרוטי פוליפרופילן חדש בנפח 50 מיליליטר.