בידוד בלוטות פונדיות קיבה: שיטה לבידוד בלוטות פונדיות מרקמת קיבה אנושית

אצל בני אדם, הפונדוס הוא החלק העליון ביותר של הקיבה. אפיתל פונדי מורכב מבלוטות קיבה רבות המפרישות מיץ קיבה, המסייע לעיכול.

כדי לבודד את בלוטות היסוד של הקיבה, התחל בלקיחת רקמה פונדית אנושית בכוס. הוסף חיץ מתאים לכוס ושטוף את רקמת היסוד במרץ. שטיפה מסירה את הפסולת המזהמת והדם מרקמת היסוד.

מעבירים את הרקמה הנקייה לצלחת פטרי. בעזרת גזה סטרילית יש לנגב את שכבת הרירית המגנה ובכך לחשוף את שכבת האפיתל הבסיסית. בעזרת מלקחיים מגרדים בכוח את שכבת האפיתל העליונה מהרקמה.

מעבירים את האפיתל המגורד לצלחת פטרי אחרת וטוחנים אותו לחתיכות קטנות יותר. מוסיפים את החתיכות הטחונות לבקבוק המכיל חיץ בתוספת אנזימי קולגנאז. דגירה בטמפרטורה הרצויה עם תסיסה מתמדת למניעת גושים.

קולגנאז מעכל את חלבוני המטריצה החוץ-תאיים הקיימים בשכבת האפיתל, ומשחרר את בלוטות הפונדיק לתוך השעיה. מסננים את המתלה לצינור טרי כדי להסיר גושים לא מפורקים.

שמור על תסנין הבלוטות ללא הפרעה על קרח כדי לשקע את הבלוטות. השליכו את הסופרנטנט המכיל פסולת תאים והשעו מחדש את משקעי הבלוטות במאגר טרי. צנטריפוגה ואחסן את כדור הבלוטה עד לשימוש נוסף.

כדי להתחיל, אסוף את הרקמה המוכנה במיכל פלסטיק גדול מלא ב-DPBS ללא סידן/מגנזיום. השאירו את מיכל הפלסטיק על קרח עד לשימוש. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים יש לשטוף את הרקמה במרץ בכוס סטרילית, המכילה 100 מיליליטר DPBS ללא סידן/מגנזיום, למשך כ-30 שניות. לאחר מכן, השתמש בגזה סטרילית כדי לנגב את שכבת הריר מהאפיתל.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים גדולים כדי להחזיק את שכבת השריר של הרקמה בחוזקה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים המוסטטיים גדולים ומעוקלים וגרד את האפיתל בכוח. אחסן את האפיתל הגרוט בצלחת פטרי פוליסטירן סטרילית. כדי לייעל את עיכול הרקמות, טחנו את רקמת האפיתל לשברים. לאחר מכן, שטפו את הטישו עם DPBS ללא סידן/מגנזיום בתוספת אנטיביוטיקה.

שטפו מספר פעמים כדי להסיר את הדם. השליכו את הכביסה בכוס פסולת. לאחר מכן, אוספים את שברי האפיתל השטופים בבקבוק תחתון עגול מזכוכית בנפח 125 מיליליטר עם מוט ערבוב של 25 מיליליטר ומדיום דגירה מחומם מראש. לאחר איסוף שברי הרקמות, אטמו את הבקבוק התחתון העגול בעזרת מחיצות גומי. לאחר מכן, הכנס מחט עמוד שדרה 20G למחיצות. חבר את המחיצה למיכל חמצן עם צינור גומי.

הכנס 10 עד 15 מחטי יציאה לתוך המחיצה כדי למנוע את הקרע שלה ולאחר מכן השתמש ב-clamps כדי להדק את ההתקנה למעמד טבעת. לאחר מכן, הפעל את זרימת החמצן על נמוך. לאחר מכן, כיילו את אמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על צלחת ערבוב למשך 30 עד 45 דקות. לאחר הכיול, הנח את ההתקנה באמבט המים. לאחר 15 דקות של דגירה, בדוק אם יש בלוטות מנותקות.

לאחר זמן הדגירה הרצוי, הוסף 50 מיליליטר של DMEM/F-12 שחומם מראש למדיום הדגירה באמצעות פיפטה סרולוגית. לאחר מכן, מסננים את תערובת הבלוטות המתקבלת דרך גזה סטרילית בארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. לאחר מכן, דגרו את המסנן על קרח למשך 15 דקות. זה יאפשר לבלוטה להתיישב בתחתית הצינור החרוטי. השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להשליך 40 מיליליטר של הסופרנטנט מהחלק העליון של תרחיף הבלוטה.

השעו מחדש את 10 המיליליטר הנותרים של תערובת הבלוטות ב -10 מיליליטר DPBS בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר מכן, מחלקים את כל התערובת למבחנות תרבית תאים של 5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות ב 65 x גרם למשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט.