הכלאת בדיקה והגברת אותות בהכלאה של RNA באתרו: טכניקה לאיתור רצפי RNA ספציפיים במקטעי רקמות

כדי לזהות רצף RNA ספציפי בתא, התחל בלקיחת קטע רקמה על שקופית זכוכית. שכבו את קטע הרקמה עם מאגר הכלאה מתאים המכיל את בדיקות ה-RNA המטרה.

בדיקות אלה הן מולקולות RNA בצורת Z בעלות חלק זיהוי מטרה בקצה אחד ורצף זנב בקצה השני. זרוע מרווח מקשרת בין שני הקצוות הללו.

כעת, דגרו את השקופית בתנור הכלאה בטמפרטורה אופטימלית. בדיקות RNA בצורת Z נכנסות לתא ומתכלאות עם רצף ה-mRNA המתאים בזוגות.

מוציאים את השקופית מהתנור. טבלו את השקופית בתמיסת כביסה כדי להסיר בדיקות לא קשורות ומאגר הכלאה עודף.

לאחר מכן, הוסף תמיסת מגבר מקדים ודגירה. מולקולת הקדם-מגבר מתחברת לרצף הזנב של שני בדיקות Z סמוכות. מולקולה זו אינה נקשרת לבדיקה Z אחת, מה שמבטיח ספציפיות.

לאחר מכן, מוסיפים את תערובת המגיב המגבר ודוגרים. מולקולות מגבר מרובות עוברות הכלאה לרצף הקדם-מגבר היחיד.

לבסוף, סמן את קטע הרקמה עם בדיקות התיוג הרצויות כדי לזהות נוכחות של רצף RNA ספציפי בתא.

כדי להתחיל הכלאה, הקש והחלק את השקופיות כדי להסיר עודפי נוזלים ולהחזיר אותם למתלה השקופיות. הוציאו את בדיקת ה-HPV שחוממה מראש מהתנור והוסיפו כארבע טיפות כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מכסים את המגש במכסה ומכניסים לתנור למשך שעתיים בחום של 40 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הדגירה, הוציאו את המגש מהתנור והוציאו את מתלה השקופיות.

שקופית אחת בכל פעם, הסר במהירות את כל הנוזלים העודפים והנח את השקופית במתלה שקופיות שקוע בכלי מכתים מלא במאגר כביסה 1x, שטוף את השקופיות במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת, וחזור על הפעולה עם מאגר כביסה טרי פי 1. הקש והחליק כדי להסיר את עודפי הנוזלים מהשקופיות ולהניח אותם שוב במתלה השקופיות. הוסף כארבע טיפות של טמפרטורת החדר AMP1 לכל חלק כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מכסים את המגש במכסה ומכניסים לתנור למשך 30 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס.

לאחר הוצאת המגש מהתנור, הסר את מתלה השקופיות. עבדו שקופית אחת בכל פעם, הסירו במהירות את כל הנוזלים העודפים והניחו את השקופית במתלה השקופיות שקוע בכלי מכתים מלא במאגר כביסה 1x, שטפו במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת, וחזרו על הפעולה עם מאגר כביסה טרי 1x.