אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 2:42 דק׳ • April 30th, 2023
כדי לזהות אותות כרומוגניים במהלך הכלאת RNA, התחל בלקיחת קטע רקמה על מגלשת זכוכית. קטע זה מכיל RNA מטרה, הכלאה מראש עם בדיקת RNA עם תווית חזרת פרוקסידאז.
יש להוציא כמה טיפות של diaminobenzidine או DAB, מצע זיהוי, על קטע הרקמה ולדגור.
DAB נכנס לתא, ואנזים חזרת פרוקסידאז מחמצן אותו ליצירת משקע חום. תגובה זו מעניקה צבע חום לרצפי RNA ספציפיים בתא. לתאים שאינם מכילים RNA מטרה לא תהיה פעילות פרוקסידאז ויישארו לא מוכתמים.
לאחר מכן, הכתים את קטע הרקמות עם המטוקסילין. המטוקסילין נקשר ל-DNA ומעניק כתם סגול לחלק הרקמה.
טפל בקטע הרקמות במי אמוניה - תמיסה כחולה. זה מפחית את עוצמת הכתם הסגול, מה שגורם לתאים להיראות כחולים. שלב זה חיוני להדמיה ברורה של הכתמים החומים בתוך התאים.
כעת, טבלו את קטע הרקמה בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול ולאחר מכן טפלו בו בקסילן - ממס אורגני. שלבים אלה מייבשים את קטע הרקמה כדי לקבל תמונות טובות יותר.
לבסוף, אטום את השקופית עם תמיסת הרכבה וכיסוי ודמיין תחת מיקרוסקופ אור. התאים מציגים נקודות חומות מנוקבות המצביעות על נוכחות של RNA מטרה.
הוצא את אותו מספר טיפות של כל תמיסת DAB-A ו-DAB-B בצינור בגודל מתאים כדי ליצור כ-120 מיקרוליטר של מצע DAB לכל קטע ומערבולת. קח כל שקופית, אחת בכל פעם, ממתלה השקופיות והקש והחליק כדי להסיר עודפי נוזלים, והנח אותו בחזרה במתלה השקופיות. פיפטה כ-120 מיקרוליטר של תערובת DAB על כל קטע רקמה, וודא שהחלקים מכוסים. יש לדגור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהמשיך בכתמים נגדיים.
הנח טיפה אחת של מדיום הרכבה לכל לוח זכוכית ולאחר מכן הנח את הלוח על השקופיות ותן להן להתייבש באוויר. לאחר מספר שעות, המשך בהערכה באמצעות מיקרוסקופ אופטי כמתואר בכתב היד.