ייצור מטריצה חוץ-תאית ממודל עכבר: הליך יעיל להכנת מטריצה חוץ-תאית לשון דה-תאית מלשון מורין

המטריצה החוץ-תאית או ECM - המרכיב הלא תאי של סביבת הרקמה - מורכבת מרשת מורכבת של חלבונים מבניים ורגולטוריים ופוליסכרידים המופרשים על ידי תאים. ה-ECM מספק תמיכה מבנית וביוכימית לתאים ומווסת את צמיחתם.

כדי להכין את המטריצה החוץ-תאית של הלשון, התחל בלקיחת לשון עכבר שזה עתה נקטפה. שטפו אותו באתנול כדי להסיר את שכבת השומנים שלו.

לאחר מכן, הכניסו אותו למחזורי הקפאה והפשרה לסירוגין. הקפאה מקדמת היווצרות גבישי קרח תוך תאיים, בעוד שהפשרה ממיסה את גבישי הקרח, וכתוצאה מכך משבשת את קרום התא.

כעת, השעו את הלשון בתמיסה אנטיביוטית כדי לעכב צמיחת חיידקים. לאחר מכן, טפל באיבר בתמיסת מלח היפרטונית. בנוכחות ריכוז מומס גבוה, מים זורמים החוצה מהתאים וגורמים להם להתכווץ. שלב זה מסייע במוות תאי ובניתוק מהמטריצה החוץ-תאית.

דגירה על הלשון בחומר פעילי שטח לא יוני. חומר פעילי השטח מסיס לחלוטין את הממברנות התאיות והגרעיניות, ומקל על שחרור תוכן תוך תאי לתמיסה.

לבסוף, השעו את הלשון בתמיסה המכילה יוני סידן ומגנזיום, ולאחר מכן טיפול בנוקלאזות. יוני הסידן והמגנזיום משפרים את פעילותם של נוקלאזות כדי לפרק כל חומצות גרעין חופשיות בתמיסה.

אחסן את רקמת הלשון נטולת התאים במאגר מתאים עד לעיבוד נוסף.

לאחר בידוד הלשונות מעכברים שהומתו על פי פרוטוקול הטקסט, טבלו את הרקמה באתנול 75% למשך 3 דקות. לאחר מכן, העבירו כל לשון לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר עם 1 מיליליטר של PBS סטרילי של 10 מילי-מולאר. כדי לבצע ליזה של תאים, הקפיאו את הלשונות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הפשירו את הרקמה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. חזור על ההקפאה-הפשרה פעמיים נוספות.

לאחר מכן, בצלחת תרבית בגודל 3.5 ס"מ או 6 ס"מ המכילה 75% אתנול, השתמש במחט כירורגית כדי להעמיס כל לשון על פיסת תפר כירורגי, ובעזרת חתיכה קטנה של נייר כסף סטרילי, עטוף את קצה התפר. בצלחת תרבית בגודל 3.5 ס"מ או 6 סנטימטרים, השתמש ב -3 מיליליטר PBS כדי לשטוף כל לשון למשך 30 שניות. לאחר מכן, בבקבוק עם פה רחב, הכינו 90 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין ב-250 מיליליטר מים סטריליים טהורים במיוחד והוסיפו מוט ערבוב.

הורידו עד 5 לשונות לתוך הבקבוק עד שהן במרחק של כ-2 סנטימטרים מהתחתית והדקו את הפקק כשחלק מהתפר נשאר מחוץ לבקבוק. הניחו את הבקבוק על מערבל מגנטי למשך 12 שעות. לאחר מכן, לאחר הדגירה, הכינו 250 מיליליטר של 90 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין בנתרן כלורי סטרילי 1 מולארי. מעבירים את הלשונות ומערבבים לתוך הבקבוק ומבריגים את הפקק. הניחו את הבקבוק על המערבל המגנטי למשך 24 שעות.

לביצוע ליזה של תאים, הכינו 90 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין ב -250 מיליליטר טריטון X-100 סטרילי 2% ב- PBS. מעבירים את הלשונות ואת מוט הערבוב לבקבוק ומהדקים את המכסה. לאחר מכן, ערבבו את הבקבוק במשך 48 שעות. לאחר הכנת סידן כלורי ומגנזיום כלוריד עם אמפיצילין, העבירו את הממחטה וערבבו לתוך הבקבוק וערבבו את הבקבוק במשך 24 שעות.

הכן 1 מיליליטר של 300 מיקרו-מולרי DNase ב-HBSS בצינור מיקרו-צנטריפוגה אחד עבור כל דגימת לשון. העבירו את הלשונות לתוך הצינורות כשאותו חלק של תפר תלוי בחוץ. לאחר מכן, דגרו על הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. העבירו את הדגימות בחזרה לבקבוק עם פה רחב של PBS סטרילי עם אמפיצילין והניחו אותו על הבוחש למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, אחסן את המטריצה החוץ-תאית של הלשון המוכנה, או TEM, ב-PBS סטרילי ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.