הקמת מודל תלת-ממדי של תרבית משותפת של גרעיני שורש מורין דורסלי ותאים סרטניים: מודל במבחנה לחקר פלישת תאי סרטן פריעצביים

פלישה פרינוירולית או PNI מתייחסת לנדידה של תאים סרטניים לאורך העצבים ופלישתם לאחר מכן לפרינוריום - מיקרו-סביבה מתאימה לצמיחת סרטן וגרורות.

כדי לחקות PNI במבחנה, התחל בהוספת טיפה של מטריצה חוץ-תאית או תרחיף ECM על צלחת תרבית כך שהיא תקבל צורה של חצי כדור. כעת, דגרו את צלחת התרבות כדי לחזק את התכונות המבניות והפונקציונליות של פיגום התלת מימד.

לאחר מכן, הניחו בזהירות גנגליון שורש גבי שנקטף מראש או DRG, מקבץ של נוירונים חושיים, במרכז טיפת ה-ECM המוצקה למחצה. דגירה כדי להטמיע את ה-DRG בתוך טיפת ה-ECM.

לאחר מכן, הוסף מצע גידול מתאים ודגר. ה-ECM בתוספת החומרים המזינים מעודד הנבטה של DRG לבליטות עצביות קטנות הנקראות נויריטים הגדלים באופן רדיאלי לכיוון היקף הטיפה.

הסר את המדיום המושקע כדי להכין את טיפת ה-ECM לבדיקה הבאה. זרעים צבועים פלואורסצנטיים בתאי סרטן דבקים מעל הטיפה. בשל הצורה החצי כדורית, תאי סרטן מתגלגלים ומתיישבים לאורך פריפריה הטיפתית.

דגרו את צלחת התרבית כדי לאפשר אינטראקציה בין תא סרטני לנויריט. כאשר מסתכלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ניתן לראות את תאי הסרטן עוקבים לצד הנויריטים ונודדים לעבר ה-DRG, מה שמאשר פלישה פרינוירולית.

כדי להכין את טיפות המטריצה המוצקות למחצה, העבירו צלחת זכוכית תחתונה אחת מקרח על גוש קרח מתחת למיקרוסקופ ההפעלה. הניחו את קצה הפיפטה של לא יותר מ-10 מיקרוליטר ישירות על הזכוכית בזווית של 45 מעלות והוציאו בזהירות טיפת מטריצה של 1.5 מיקרוליטר על הזכוכית. הרחיקו לאט את קצה הפיפטה מהזכוכית כאשר המטריצה מתחברת לצלחת.

הפקידו טיפה אחת של מטריצה על כל אחת מארבע פינות הצלחת והעבירו את הצלחת למשטח בטמפרטורת החדר למשך כדקה. כאשר המטריצה התקשחה מעט, החזירו את הצלחת לגוש הקרח והשתמשו במלקחיים מיקרוסקופיים סגורים כדי לגרוף את ה-DRG בעדינות ביד שמאל.

בעזרת יד ימין, העבירו בזהירות את רקמת העצב לקצה מחט 21G והשתמשו במחט כדי להכניס בעדינות את ה-DRG לאמצע טיפת המטריצה. ה-DRG אמור להשתחרר בקלות לתוך המטריצה למיקום מרכזי עם המחט.

לאחר הכנסת חתיכת DRG לכל אחת מארבע הטיפות, הנח את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. כאשר כל ה-DRG הוטמע, החזק את הלוחות בזה אחר זה בזווית קלה והוסף לאט לאט 4 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS לצלחות כך שהמדיום רק בא במגע בהדרגה עם יחידות המטריצה-DRG.

החזירו את הצלחות לחממה למשך 48 עד 72 שעות נוספות. כאשר הנויריטים מגיעים לפחות ל-75% מהדרך לקצה המטריצה, שאפו את המדיום מהבארות מבלי להסיר את יחידות המטריצה-DRG. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר עם הדק חלק, הניחו שתי טיפות של 3 פעמים 10 עד התאים החמישיים למיליליטר מדיום מעל כל בדיקת DRG מטריצה והחזירו את הצלחות לחממה. לאחר שעה, הוסיפו בעדינות 4 מיליליטר DMEM עם 10% FBS לאורך הדופן של צלחת הזכוכית התחתונה והחזירו את הצלחות לחממה עד להערכה המיקרוסקופית הבאה שלהן.