JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 5:22 דק' • April 30th, 2023
גידול מכיל חלק קטן של תאים דמויי גזע הידועים כאוכלוסיית הצד. תאים אלה עמידים לכימותרפיה, מה שהופך אותם לאחראים להישנות הסרטן.
כדי לבודד את אוכלוסיית הצד של תאים סרטניים, התחל בהוספת Hoechst - תמיסת צבע פלואורסצנטית - לבקבוקון המכיל תרחיף תאים סרטניים. בתוך תאי סרטן רגילים, מולקולות הוכסט נכנסות לגרעין ונקשרות לאזור העשיר ב-A-T ב-DNA, מה שמוביל לפלואורסצנטיות גבוהה בתאים אלה.
לעומת זאת, אוכלוסיית הצד מכילה ריכוז גבוה של טרנספורטרים ABC - משאבות פליטה המסירות במהירות את מולקולות הצבע מהתא. השטף הפעיל הזה של מולקולות צבע גורם לאוכלוסיית הצד לזרוח בעוצמה נמוכה.
כעת, קחו בקבוקון נוסף של תאים סרטניים שטופלו על ידי הוכסט והוסיפו לו ורפמיל. בקבוקון זה משמש כבקרה מכיוון ש-Verapamil חוסם את מובילי ה-ABC. שלב זה גורם להפחתה בפליטת הוכסט ושומר על הצבע בתוך תאי האוכלוסייה הצדדית.
לאחר מכן, צבעו את התאים בשני הבקבוקונים באמצעות פרופידיום יודיד. פרופידיום יודיד נכנס אך ורק לגרעין התאים המתים ומשתלב בין בסיסי ה-DNA. זה מוביל לפלואורסצנטיות גבוהה בתאים המתים.
לבסוף, מיין את התאים באמצעות ממיין תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי או FACS. FACS מפריד בין תאי גידול פלואורסצנטיים מאוד, השומרים על Hoechst ותאים מתים מתאי אוכלוסיית הצד הפלואורסצנטיים הנמוכים.
כדי לבחור אוכלוסיית צד של תאים דמויי גזע סרטניים על ידי בדיקת פליטת צבע של Hoechst, ראשית, סמן צינור חרוטי אחד "Hoechst" ואחד "Hoechst and Verapamil". לאחר מכן, שטפו תרבית תאים HNSCC עם PBS סטרילי, ואחריה תוספת של 1 מיליליטר של טריפסין-EDTA. לאחר 3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עצרו את התגובה עם מדיום תרבית תאים טרי וספרו את התאים. מדללים את התרבית ל -1 כפול 10 עד התאים השביעיים למיליליטר במדיום קו תאי הורים שלם.
לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר לצינור "Hoechst and Verapamil" ו -4 מיליליטר תאים לצינור "Hoechst". לאחר מכן, ערבבו בעדינות 10 מיקרוליטר של תמיסת Verapamil hydrochloride של 5 מילי-מולרית לתוך דגימת "Hoechst and Verapamil", ואחריה 5 מיקרוליטר של Hoechst לכל 1 כפול 10 עד התאים השישיים לשני הצינורות. לאחר מכן, מכסים את הדגימות בנייר אלומיניום ומניחים אותן על 37 מעלות צלזיוס. לאחר 90 דקות עם ערבוב עדין כל 15 דקות, צנטריפוגה את הצינורות והשעיה מחדש את הכדורים ב -2 מיליליטר PBS.
לאחר צנטריפוגה שנייה, השעו מחדש את גלולת "Hoechst and Verapamil" ב-500 מיקרוליטר של יודיד פרופידיום ב-PBS ואת הגלולה "Hoechst" ב-4 מיליליטר מאותו הדבר. כעת, סנן את הדגימות דרך מסנני תאים של 70 מיקרון לתוך צינורות FACS כדי להסיר אגרגטים ולהניח את הדגימות על קרח מוגן מאור. לאחר מכן, טען את דגימת "Hoechst" על ציטומטר הזרימה ופתח את חלון "גיליון עבודה גלובלי" בתוכנת ציטומטר הזרימה. לחץ על "עלילת נקודות" כדי ליצור גרף בגליון העבודה הגלובלי ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור את פרמטרי הפיזור קדימה וצדדית.
צור פיזור צדדי רחב על ידי גובה פיזור צדדי, עלילת נקודות באותו אופן ולאחר מכן לחץ על "שער מצולע" כדי ליצור אזור P1 בגרף השני כדי לבחור את התאים הבודדים ולהבחין בין הכפילים. לאחר מכן, צור אזור Hoechst אדום על ידי עלילת נקודות שטח Hoechst כחולה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התאים כדי להדגיש את אוכלוסיית P1. לאחר מכן, צור אזור P2 כדי לבחור את אוכלוסיית התאים השלילית של צבע Hoechst המופיעה כזרוע צד משמאל לאוכלוסיית התאים העיקרית ולאסוף 10,000 מאירועי הדגימה של "Hoechst".
כדי לוודא ששער P2 המייצג את אוכלוסיית הצד ממוקם נכון, אסוף גם 10,000 אירועי דגימה של "Hoechst ו-Verapamil". האוכלוסייה הצדדית אמורה להיעלם. לאחר מכן, מיין את אוכלוסיית הצד של תאים שליליים בצבע Hoechst לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר של מדיום תאים דמוי גזע סרטני שלם. בסוף המיון, סובב את התאים והשהה מחדש את גלולת האוכלוסייה הצדדית במיליליטר אחד של מדיום תאים דמוי גזע סרטני שלם טרי. לאחר מכן, ספרו את התאים וזרעו אותם במספר המתאים לתוך בקבוק תרבית תאים חדש.