יישום מיקרופלואידיקה Electrophysiology
1 באוקטובר 2007
שמי הוא דייב אדינגטון. אני פרופסור עוזר במחלקה להנדסה ביומדית באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. התחום שבו אנו עוסקים בעיקר הוא יישום של מיקרו-טכנולוגיות ליישומים ביו-רפואיים, ובמיוחד שימוש במכשירים למיקרופלואידיקה.
והיום נראה לכם את אחד הפרויקטים שלנו, הכולל שימוש במכשיר מיקרופלואידי המותאם לתא perfussion סטנדרטי של פרוסות מוח, כדי לספק גירוי מרחבי-זמני לפרוסת מוח. כיום, בהכנות של פרוסות למיקרו-אלקטרופיזיולוגיה, היישומים העיקריים של מוליכים עצביים לפרוסה הם או באופן גלובלי על פני כל פרוסת המוח – כלומר, אנו מגריים את כל פרוסת המוח בבת אחת, או באמצעות מיקרו-פיפט להזרקה מהירה (puff) של מוליכים עצביים בנקודות זמן שונות.
פרוסת המוח היא מבנה מורכב מאוד, וכשמחילים מוליכים עצביים באופן גלובלי או משתמשים במיקרו-פיפט, לא ניתן לשחזר דפוסי גירוי in vivo. לעומת זאת, באמצעות הפלטפורמה שלנו, אנו יכולים לשלוט בגירוי באזורים ספציפיים מאוד ברחבי פרוסת המוח ולהשיג גירוי הדומה יותר למצב in vivo. כאן מוצגות מערכות פרפוזיה עדכניות, כאשר הן מעוגנות לפסלת זכוכית כיסוי סטנדרטית.
אלה מאפשרים למצע להישטף לאורך כל הפרוסה. עם זאת, לא ניתן לשלוט מרחבית ברזולוציה של המוליך העצבי באמצעות מכשיר הגירוי. לכן, פיתחנו מכשיר micro flic המתחבר לתא פרפוזיה סטנדרטי זה.
לפיכך, ניתן להשתמש בכל בדיקות האלקטרופיזיולוגיה הסטנדרטיות. המאפיין השונה היחיד הוא שבמקום תחתית מזכוכית, המערכת מורכבת מהתקן PDMS הכולל מספר חורים שעוברים דרכו ומחוברים לתעלות מיקרופלואידיות, אשר מחוברות לפתחים בתא הפרפוזיה העליון; דרך חורים אלו, דרך התעלות ומתוך הנתיבים, אנו יכולים להעביר מוליכים עצביים אל תוך פרוסת המוח. להזרמת הנוזלים אנו משתמשים בטכניקה הנקראת שאיבה פסיבית.
לכן איננו זקוקים למערכת צינורות מורכבת שיוצאת מהמכשיר, מכיוון שאלקטרופיזיולוגיה היא כבר פרוצדורה מורכבת מאוד. על ידי פישוט עיצוב המכשיר ושימוש בשאיבה פסיבית, אנו מפשטים את הפרוטוקול הניסויי של יישום המכשיר המיקרופלואידי הזה. מבנה המכשיר הוא רשת מיקרופלואידית בעלת שתי שכבות.
השכבה הראשונה היא תעלולי הניתוב המתחברים לנתיבי היציאה, והשכבה השנייה מורכבת מחורי מעבר אלו המחברים את התעלולים לבאר. ייצור זה מבוצע באמצעות שלבי מיקרו-פבריקציה סטנדרטיים לשתי שכבות, שבהם קיימים סימני יישור המבטיחים שחורי המעבר (vias) ממוקמים ישירות במרכזם של ארבעת התעלולים הללו. התקן זה תוכנן להתחבר לתא הפרופיוזיה (profusion chamber) הסטנדרטי, כך שניתן להשתמש בכל אותן בדיקות אלקטרופיזיולוגיות.
כך נוכל להניח זאת על מערך אלקטרופיזיולוגי, להביא את העדשה אל תוכו, לספק גרייה מקומית דרך הערוצים המיקרופלואידיים שלנו, ולא לסבך שלא לצורך את מערך הניסוי מעבר לנדרש. על ידי שמירה על תכנון פשוט ככל האפשר של המכשיר, נוכל להפיץ פלטפורמה זו בצורה קלה הרבה יותר. במבנה הנוכחי שלנו, ישנם ארבעה V-ים במרכז הערוצים המיקרופלואידיים, אך ניתן להתאימם לצרכים של מעבדות שונות, בהתאם לאזור במוח אותו הן חוקרות.
כך שניתן יהיה להקדיש אזור אחד למחקר של ההיפוקמפוס ואזור אחר למחקר של קליפת המוח החיצונית. לפיכך נוכל לעורר את האזורים הללו בהתאם לאופן שבו נתכנן את המכשיר המיקרופלואידי. ומכיוון שהמכשיר אינו דורש רכיבים חיצוניים להפעלה, כל מה שנדרש הוא מיקרו-פיפטה כדי להעביר נוזלים לפתחים אלו באמצעות טכניקת שאיבה פסיבית.
אין צורך בציוד נוסף מעבר לתשתית תחטית זו שמעבדה סטנדרטית לאלקטרופיזיולוגיה צריכה לרכוש כדי להשתמש במכשיר זה. עד לשלב זה בפרויקט, התמקדנו בחיבור של התעלות המיקרופלואידיות לתאי הפרפוזיה הסטנדרטיים. כעת, החלק הבא של הפרויקט הוא בדיקה של המכשיר במחקרים המבוססים על השערות באמצעות תכשירים של פרוסות רקמה אלו.
וכך הדגמנו כי באמצעות שימוש בצבע פלואורסצנטי, ניתן לגרות מרחבית אזורים שונים על ידי הזרקה של אנלוגים פלואורסצנטיים אלה לתוך התעלות. השלב הבא הוא ביצוע הניסויים הביולוגיים בפועל. לפיכך, תחום המיקרופלואידיקה מגיע לנקודת מעבר.
אנו עוברים משלב ההדגמות של הוכחת היתכנות (proof of concept) לשימוש ממשי במכשירים אלו כדי לגלות דברים חדשים ומרגשים שבעבר לא ניתן היה לבצע. לפיכך, התחום עובר מטכניקות שבהן השתמשנו בעקרונות הזמינים בקנה מידה מיקרוסקופי, כגון דיפוזיה מהירה, זרימה למינרית, יחסי שטח פנים לנפח גדולים ואינטגרציית תהליכים, ואנו עומדים כעת להשתמש בעקרונות אלו ולהשליכם כדי לפתור צרכים שטרם נענו במעבדה ובמרפאה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן ביישום של התקני מיקרופלואידיקה במדעי המוח, ובמיוחד עבור גרייה מרחבית-זמנית של פרוסות מוח. השיטה משפרת את הדיוק של יישום המוליכים העצביים בהשוואה לטכניקות מסורתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביו-הנדסה
- מיקרופלואידיקה
רקע
- הכנות של פרוסות לרังשואלקטרופיזיולוגיה נמצאים בשימוש נפוץ במדעי המוח.
- השיטות הנוכחיות להחדרת מוליכים עצביים מוגבלות בדיוקן.
- התקנים מיקרופלואידיים מציעים גישה חדשנית לשיפור טכניקות של גרייה.
- ניתן להתאים תאי פרפוזיה סטנדרטיים לפרוסות מוח לצורך שיפור הפונקציונליות.
מטרת המחקר
- להדגימ התקן מיקרופלואידי המאפשר גרייה מרחבית-זמנית של פרוסות מוח.
- לשפר את יישום המוליכים העצביים במחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
- לספק סביבה מבוקרת יותר עבור ניסויים בפרוסות מוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח התקן מיקרופלואידי התואם לתאי פרפוזיה של פרוסות מוח.
- יישום של מוליכים עצביים באמצעות המערכת המיקרופלואידית.
- השוואה בין טכניקות גרייה: גרייה גלובלית לעומת גרייה מקומית.
- מדידות אלקטרופיזיולוגיות להערכת יעילות הגרייה.
תוצאות עיקריות
- ההתקן המיקרופלואידי מאפשר בקרה מדויקת של אספקת מוליכים עצביים.
- סטימולציה מרחבית-זמנית מראה תוצאות משופרות בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- תוצאות ניסויים משופרות בהכנות של פרוסות מוח.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקרים בנוירומדע.
מסקנות
- התקנים מיקרופלואידיים משפרים משמעותית את יישום המוליכים העצביים בתוך פרוסות מוח.
- טכנולוגיה זו יכולה לקדם מחקרים אלקטרופיזיולוגיים ומחקרים קשורים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים נוספים של שיטה זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
שילוב זה של מיקרופלואידיקה ואלקטרופיזיולוגיה נותן מענה לצורך מרכזי שלא סופק בגילויים במדעי המוח: השגת אספקה של נוירומודולטורים לבתיחות מוח תחת בקרה מרחבית וזמנית. על ידי אפשור דפוסי גרייה ספציפיים לאזור המדמים טוב יותר תנאי in vivo, הפלטפורמה מגבירה את הביטחון החזוי באימות יעדים ובהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור תוכניות לגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). עיצוב השאיבה הפסיבי והפשוט תומך באימוץ רחב במגוון תהליכי עבודה אלקטרופיזיולוגיים ללא צורך בתשתיות ייעודיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות בקרה מרחבית מדויקת של יישום נוירומודולטורים באזורי מוח מוגדרים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך במניפולציה של מיקרו-פיפטות, ובכך מפחית שונות טכנית בניסויי הזרקת מוליכים עצביים.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי שחזור דפוסי גרייה הרלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר פרפוזיה גלובלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות פרוסות מוח מאושרות לסריקת תרכובות בהמשך, באמצעות ביסוס פרוטוקולי סטימולציה מקומיים וניתנים לשחזור.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה של תגובות אלקטרופיזיולוגיות ספציפיות לאזור, ובכך מאפשר ניתוחי תגובה למינון וניתוחים קינטיים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתן להתאמה לאזורי מוח שונים (למשל, hippocampus, cortex) באמצעות תכנון מחדש של התעלים המיקרופלואידיים, ובכך תומך במערכי סריקה מרובי מטרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה לבדיקת השפעות של נוירומודולטורים ברקמה עצבית מובנית.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהירה השפעות של תרופות על מסלולים ספציפיים באמצעות גרייה אזורית מבודדת, ובכך מפחיתה עמימות במחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
- קידום מותאם סיכונים: מספקת מידע להחלטות של go/no-go על ידי חשיפת יעילות תלוית-אזור ואותות של השפעות לא רצויות (off-target) בשלב מוקדם של תהליך הגילוי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת מחקרים מכניסטיים בעלי רזולוציה מרחבית המשפרים את הביטחון בבחירת מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ובאופטימיזציה של מולקולות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לבידוד משתנים בלתי תלויים (למשל, חשיפה אזורית לנוירומודולטורים) בהכנות עצביות מורכבות.
- סריקה: משפרת את השחזוריות של הבדיקות ואת הקריאות הכמותיות באמצעות אספקת נוזלים סטנדרטית המונעת על ידי משאבה פסיבית דרך ערוצים מיקרופלואידיים.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות אלקטרופיזיולוגיות ספציפיות לתנאי הניסוי, המאפשרות לצוותים להשוות תגובות אזוריות ולהעריך את העוצמה והסלקטיביות של חומרים מעוררים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני על ידי שימוש בחתכי מוח כמערכת רלוונטית למחלה להערכת השפעות של נוירומודולטורים בארכיטקטורה רקמתית שנשמרה.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכננה כפלטפורמה רב-פעמית התואמת לתאי פרפוזיה סטנדרטיים, ובכך ממזערת את הצורך בוולידציה חוזרת בין מעבדות ופרויקטים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות גירוי נשלט מרחבית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות שאיבה פסיבית, ובכך מבטל את התלות במשאבות חיצוניות או בצנרת מורכבת.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לבדיקות אזוריות מרובות (multiplexed) בתוך מערך אלקטרופיזיולוגי יחיד, ובכך מפחית את הכפילויות בבדיקות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון על ידי אספקת נתונים ברורים יותר לגבי קשר מבנה-פעילות ומעורבות מטרה (target engagement) באזורי מוח שונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בהתקנים מיקרופלואידיים ובשילוב מערכות אלקטרופיזיולוגיה.
- תלוי בגישה לתאי פרפוזיה סטנדרטיים לפרוסות מוח ומערכות דימוי מיקרוסקופיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת עגינה עקבית של ההתקן ויישור הערוצים בין המשתמשים.
- כולל שיקולי התאמה בעת פנייה לאזורי מוח שונים, באמצעות עיצוב מחדש של ה-via וסידורי הערוצים במיקרופלואידקה.
- מוגבל על ידי הצורך בתיקוף פלואורסצנטי או אלקטרופיזיולוגי כדי לאשר מסירה מוצלחת של נוירומודולטורים לאזורי המטרה.
