צביעת DNA חוץ-תאית: שיטה לזיהוי DNA חוץ-תאי בקטעי רקמת FFPE

תא גוסס משחרר חלק מהדנ"א מחוץ לתא שנקרא הדנ"א החוץ-תאי. כדי להכתים DNA חוץ-תאי, התחל בלקיחת קטע רקמה משובץ פרפין קבוע בפורמלין, או FFPE, על שקופית זכוכית. מחממים את שקופית הזכוכית למשך הזמן הרצוי. זה מקל על הצמדת הרקמה על משטח המגלשה ומרכך את הפרפין שמסביב.

טבלו את השקופית בנוזל דה-פרפיניזציה כדי להמיס לחלוטין את שכבת הפרפין סביב הרקמה. לאחר מכן, טבלו את המגלשה בריכוזים יורדים של אתנול כדי להחזיר לחות לרקמה הפירוקה. לאחר ההתייבשות, טבלו את השקופית בתמיסת אחזור אנטיגן רותחת. טיפול זה חושף את האפיטופים ששונו במהלך תהליך הקיבוע.

כסו את השקופית בנוגדנים ראשוניים ואפשרו להם להיקשר לאפיטופים ספציפיים ללא מסכה הנמצאים בתא. לאחר מכן, הוסף נוגדנים משניים מתויגים פלואורסצנטיים, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים. טבלו את המגלשה בתמיסה של סודאן בלאק כדי להפחית את האוטופלואורסצנטיות ברקע.

לבסוף, הניחו טיפה של מדיום הרכבה בתוספת DAPI מעל קטע הרקמה ואטמו אותה עם כיסוי. דגירה כדי לאפשר למולקולות DAPI להכתים את ה-DNA. דמיין את קטע הרקמה המוכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אפיטופים בעלי תווית פלואורסצנטית בתא מסייעים להבדיל בין ה-DNA הגרעיני הקיים בתוך התא לבין ה-DNA החוץ-תאי.

לצורך צביעת DNA חוץ-תאית, ראשית, יש לחמם את הדגימות המעניינות במדף השקופיות ב-60 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפני טבילת השקופיות בשני החלפות של 40 דקות של ממס במכסה אדים. לאחר הטבילה השנייה, יש להתייבש מחדש בדגימות פעמיים ב-100% אתנול ופעם אחת ב-70% אתנול למשך 5 דקות לכל טיפול.

לאחר הטיפול האחרון, השתמש במלקחיים כדי להניח את השקופיות לתמיסת אחזור אנטיגן רותחת בסיר לחץ גבוה למשך 10 דקות. לאחר הסרת האפיטופים של האנטיגן, העבירו את סיר הלחץ מהאש לכיור והעבירו מיד מי ברז קרים על המכסה.

אפשר לשקופיות להתייצב למשך 20 דקות בתמיסת אחזור האנטיגן לפני שטיפת הדגימות פעמיים ב-0.01 PBS מולארי על שייקר אורביטלי למשך 5 דקות לכל שטיפה. לאחר השטיפה השנייה, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגולים סביב דגימות רקמת הכליה ולחסום כל צביעה לא ספציפית עם 60 מיקרוליטר של 10% סרום עוף באלבומין סרום בקר 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה, החלף בזהירות את תמיסת החסימה ב-60 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי המעניין בתא לחות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, שטפו את השקופיות על שייקר אורביטלי ב-PBS למשך 2 דקות לכל שטיפה לפני הוספת 60 מיקרוליטר של נוגדן משני מצומד פלואורופור מתאים לכל שקופית לדגירה של 40 דקות בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה, שטפו את המגלשות ב-PBS כפי שהודגם, ולאחר מכן טיפול ב-0.3% סודאן שחור ב-70% אתנול כדי להרוות כל אוטופלואורסצנציה פוטנציאלית המושרה על ידי פורמלין. לאחר 30 דקות, שטפו את המגלשות במי ברז כדי להסיר משקעים וטבלו את המגלשות ב-PBS למשך 10 דקות כדי למנוע היווצרות משקעים נוספים של סודן בלאק.

בתום הדגירה, הרכיבו את המגלשות על כיסויי זכוכית קונפוקלית עם טיפות של 360 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה בתוספת DAPI ואטמו את הכיסויים עם לק. הניחו לשקופיות להתרפא במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. אחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנים מאור עד להדמיה על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.