צביעת DNA חוץ-תאית: שיטה לזיהוי DNA חוץ-תאי בקטעי רקמת FFPE
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 4:33 דק׳ • April 30th, 2023
תא גוסס משחרר חלק מהדנ"א מחוץ לתא שנקרא הדנ"א החוץ-תאי. כדי להכתים DNA חוץ-תאי, התחל בלקיחת קטע רקמה משובץ פרפין קבוע בפורמלין, או FFPE, על שקופית זכוכית. מחממים את שקופית הזכוכית למשך הזמן הרצוי. זה מקל על הצמדת הרקמה על משטח המגלשה ומרכך את הפרפין שמסביב.
טבלו את השקופית בנוזל דה-פרפיניזציה כדי להמיס לחלוטין את שכבת הפרפין סביב הרקמה. לאחר מכן, טבלו את המגלשה בריכוזים יורדים של אתנול כדי להחזיר לחות לרקמה הפירוקה. לאחר ההתייבשות, טבלו את השקופית בתמיסת אחזור אנטיגן רותחת. טיפול זה חושף את האפיטופים ששונו במהלך תהליך הקיבוע.
כסו את השקופית בנוגדנים ראשוניים ואפשרו להם להיקשר לאפיטופים ספציפיים ללא מסכה הנמצאים בתא. לאחר מכן, הוסף נוגדנים משניים מתויגים פלואורסצנטיים, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים. טבלו את המגלשה בתמיסה של סודאן בלאק כדי להפחית את האוטופלואורסצנטיות ברקע.
לבסוף, הניחו טיפה של מדיום הרכבה בתוספת DAPI מעל קטע הרקמה ואטמו אותה עם כיסוי. דגירה כדי לאפשר למולקולות DAPI להכתים את ה-DNA. דמיין את קטע הרקמה המוכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אפיטופים בעלי תווית פלואורסצנטית בתא מסייעים להבדיל בין ה-DNA הגרעיני הקיים בתוך התא לבין ה-DNA החוץ-תאי.
לצורך צביעת DNA חוץ-תאית, ראשית, יש לחמם את הדגימות המעניינות במדף השקופיות ב-60 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפני טבילת השקופיות בשנ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים