מדוע בדיקת השערת האפס חשובה לצורך תיקוף שלהוצאת פודיוציטים (podocyte differentiation)?

בדיקת השערת האפס חיונית כדי לקבוע האם שינויים שנצפו במאפייני הפודוציטים נובעים מפרוטוקול הדיפרנציאציה או מווריאציה אקראית, ובכך היא תומכת בתיקוף יעיל של המטרה במחקר כלייתי.

כיצד משתלבת בידוד של משתנים בלתי תלויים בתהליכי עבודה של גזירה של iPSC לפודוציטים?

בידוד משתנים כגון הרכב המצע או זמן הדגרה מאפשר לצוויות לייחס את תוצאות הדיפרנציאציה באופן ספציפי לשינויים בפרוטוקול, ובכך לשפר את האופטימיזציה בשלב הגילוי ואת השחזוריות.

מה מאפשרות מדידות כמותיות של פודוציטים במבחני נפירוטוקסיות?

הערכה כמותית של מורפולוגיית הפודוציטים וחיוניותם מאפשרת השוואה אובייקטיבית של השפעות תרכובות, ובכך תומכת בקבלת החלטות מבוססות נתונים בסריקת נפרוטוקסיות ובפיתוח בדיקות.

מדוע דרישות שחזור הן קריטיות למחקרי פודוציטים רב-תפקודיים?

שחזור מבטיח שבידוי הפודוציטים ותוצאות הבדיקה יהיו עקביים בין צוותים וניסויים שונים, ובכך מקל על שיתוף נתונים מהימן ומאמצי מו"פ שיתופיים.

אילו יכולות ניתוח סטטיסטי נדרשות לפני יישום בדיקת הפודוציטים?

נדרשים כלים סטטיסטיים חזקים כדי לנתח את יעילות הדיפרנציאציה, את השחזוריות של הבדיקה ואת השפעות הטיפול, על מנת להבטיח שנתונים המבוססים על פודוציטים עומדים בסטנדרטים של מו"פ ארגוניים לצורך קבלת החלטות.

הפקת פודוציטים בכליות אנושיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים: הליך להבחנה מכוונת של פודוציטים בוגרים בכליות מתאי גזע

JoVE Encyclopedia of Experiments

מחקר סרטן

0 צפיות • 4:19 דק' • April 30th, 2023

ניתן לתכנת מחדש תאים בוגרים כדי להחזיר את מצבם דמוי תאי גזע, לא ממוין ומתפשט. תאים מתוכנתים מחדש אלה נקראים תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או IPSCs. כדי להבדיל תאים פלוריפוטנטיים לתאים המתמחים בפודוציטים המעורבים בסינון פסולת מהכליות, התחל בנטילת השעיה של IPSCs אנושיים באמצעי אינדוקציה מזודרם.

העבירו את המתלה הזה על צלחת תרבית מצופה מטריצת מרתף ודגרו. מטריצת המרתף מקלה על הידבקות של IPSCs בבסיס. לאחר מכן, הגורמים הספציפיים הקיימים בתקשורת גורמים להתמיינות של IPSCs לתאי המזודרם, תאי המבשר לפודוציטים. לשאוף את המדיה המושקעת.

השלם את הצלחת בנפח הרצוי של אמצעי אינדוקציה מזודרם ביניים ודגירה למשך זמן ממושך. שלב זה מוביל להתמיינות של תאים מזודרמליים לפודוציטים לא בשלים. החלף את אמצעי האינדוקציה הבינוני של המזודרם בתמיסת טריפסין כדי לנתק את התאים הדבקים מהצלחת.

לאחר מכן, צנטריפוגה לגלולה של התאים. השליכו את הסופרנטנט המכיל תמיסת טריפסין ושברי מטריצה. השעו מחדש את הגלולה במדיום אינדוקציה לפודוציטים. העבירו את מתלה התאים לצלחת תרבית מצופה טרייה. דגירה כדי לאפשר התפתחות של מספר בליטות דמויות כף רגל מתאי ביניים, וכתוצאה מכך היווצרות פודוציטים בוגרים.

לאחר הספירה, השעו מחדש את התאים ל-1 פעמים 10 עד התאים החמישיים למיליליטר של ריכוז מדיום אינדוקציה מזודרם ושאבו את תמיסת המטריצה החוץ-תאית ממטריצת קרום המרתף 2 צלחות מצופות. שטפו את הצלחות פעמיים במדיום חם וערבבו את תרחיף תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרה על ידי בני אדם עם פיפטינג עדין.

הוסף 1 מיליליטר תאים לכל באר של מטריצת קרום המרתף צלחות 12 בארות מצופות 2 ונער בעדינות את הצלחות כדי להפיץ את התאים בצורה אחידה יותר. לאחר מכן, הנח את הצלחת בחממת תרבית התאים. בימים 2 עד 15 של ההתמיינות, החלף את מדיום האינדוקציה של המזודרם ב-1 מיליליטר של מדיום אינדוקציה מזודרם ביניים לכל באר.

אם נצפתה צמיחה משמעותית של תאים ודלדול מהיר של חומרים מזינים כפי שמצוין על ידי הצהבה של המדיום, ניתן להגדיל את נפח מדיום ההתמיינות הבינוני של המזודרם ל -1.3 מיליליטר לבאר. ביום ה-16 של התרבית, יש לשטוף את תאי המזודרם הבינוניים במדיום חם ולדגור את התאים עם 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לבאר למשך 3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כאשר התאים מתחילים להתנתק, מגרדים את התאים בעזרת מרים תאים ומערבבים בעדינות את התאים על ידי פיפטינג. עצור את התגובה עם כ -2 מיליליטר תמיסת נטרול טריפסין לבאר והעביר את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הביאו את הנפח עד 50 מיליליטר עם מדיום ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגה.

השעו מחדש את מדיום האינדוקציה של הגלולה והפודוציטים ב-1 כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר של ריכוז בינוני והוסיפו את התאים לצלחות מצופות 2 של מטריצת קרום המרתף. לאחר מכן, נערו בעדינות את הצלחת כדי לעזור לפזר את התאים בצורה אחידה יותר והניחו את התאים באינקובטור עד 5 ימים.