Amphotericin-B מתווך תיקון מהדק תיקון: טכניקה אלקטרופיזיולוגית לחקר זרמים יוניים בתאי שלפוחית השתן

טכניקת מהדק טלאי מחורר מאפשרת מדידות בזמן אמת של זרמים יוניים הקשורים לפעילות תעלות יונים על תאים כמו שריר חלק דטרוסור, או DSM, תאים של שלפוחית השתן.

כדי להתחיל, טען את תרחיף תאי ה-DSM על תא זכוכית ודגירה כדי לאפשר היצמדות לתאים. לאחר מכן, הוסף לתאים המודבקים תמיסה חוץ-תאית המכילה יוני טטרה-אתילאמוניום וצזיום. קטיונים אלה חוסמים תעלות אשלגן על קרום התא ומעכבים את זרמי האשלגן המפריעים.

לאחר מכן, קח פיפטה מהדק תיקון מלוטשת - צינור זכוכית חלול דק המכיל אלקטרודת הקלטה המחוברת למגבר. מלאו את הפיפטה בתמיסה תוך-תאית ומלאו אותה באותה תמיסה אך מכילה אמפוטריצין-B, אנטיביוטיקה מחוררת ממברנה.

כעת, טבלו את קצה הפיפטה בתמיסה החוץ-תאית המכילה תאי DSM. לאחר הגדרת הפוטנציאל והזרם לרמות מתאימות, קדם את קצה הפיפטה לכיוון קרום התא ובמקביל עקוב אחר התנגדות האלקטרודה.

עלייה מהירה בערך ההתנגדות מצביעה על כך שקצה הפיפטה הגיע לקרום התא. כעת, הפעל יניקה עדינה על האלקטרודה כדי ליצור אטימה הדוקה הנקראת ג'יגה-אטם בין קצה הפיפטה לקרום הפלזמה.

לאחר היווצרות האטם, אמפוטריצין מתפזר לאט לתוך הקצה ומחורר את הממברנה, ויוצר נקבוביות יונים. לאחר השגת ניקוב אופטימלי, יונים נעים בין התאים לאלקטרודה, ויוצרים זרמים פרופורציונליים לתפקוד תעלת היונים.

פיפטה של 0.25 עד 1 מיליליטר של תרחיף תאים על תא עם תחתית זכוכית היושבת על במת מיקרוסקופ הפוך ודוגרת אותו למשך 45 דקות לפחות כדי לאפשר לתאים להיצמד. לאחר מכן, הוציאו את ה-DS מהאמבטיה והחליפו אותו בתמיסת E באמצעות סופר-פיוז'ן.

משוך מספר אלקטרודות תיקון, ליטוש אש את קצות האלקטרודות וציפוי הקצוות בשעווה דנטלית במידת הצורך. מלאו את קצה אלקטרודת התיקון בתמיסת הפיפטה ללא אמפוטריצין-B על ידי טבילה קצרה של האלקטרודה בתמיסה. ההצלחה של אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תלויה באיכות תאי ה-DSM ובמסיסות אמפוטריצין-B.

מלאו את האלקטרודה באותה תמיסת פיפטה המכילה אמפוטריצין-B והרכיבו את האלקטרודה על מחזיק המחובר לשלב ראש מגבר תיקון-מהדק. השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את האלקטרודה ממש מתחת לפני השטח של התמיסה החוץ-תאית כך שקצה האלקטרודה פשוט שקוע.

לאחר מכן, קבע את התנגדות האלקטרודה באמצעות פונקציית חלון בדיקת הממברנה של תוכנת הרכישה המסחרית וקדם את האלקטרודה לעבר התא המעניין. כאשר נוגעים במשטח התא עם האלקטרודה, יוצרים חותם ג'יגה על ידי הפעלת לחץ שלילי מהיר עדין על האלקטרודה באמצעות צינור. התוצאה היא לחץ שלילי בקצה האלקטרודה, וכתוצאה מכך איטום ג'יגה מוצלח כפי שאושר על ידי מבחן הממברנה.

אפשר 30 עד 60 דקות עד שהאמפוטריצין-B מתפזר במורד הפיפטה ומוחדר לקרום הפלזמה, ויוצר נקבוביות סלקטיביות בעיקר עד קטיונים חד-ערכיים. המשך לעקוב אחר הג'יגה-אטם עם פונקציית בדיקת הממברנה.

כאשר ניקוב התיקון הוא אופטימלי, בטל את ארעי הקיבול על ידי התאמת החוגות עבור קיבול התא והתנגדות הסדרה על המגבר. לאחר שנצפו זרמי המתח היציבים, רשום זרמים עם פרוטוקול שלב מתח הניתוב כמתואר בכתב היד.