בידוד אקסוזום: טכניקת אולטרה-צנטריפוגה מבוססת צפיפות המשתמשת בכרית סוכרוז כדי להפריד אקסוזומים ממדיה מותנית של תאים בתרבית

0 צפיות4:11 דק' • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים - שלפוחיות בגודל ננו, קשורות לממברנה הנושאות ביומולקולות פונקציונליות - מופרשות באופן פעיל על ידי רוב סוגי התאים וניתן לבודד אותן מסופרנטנטים של תרבית תאים במבחנה. כדי לבודד אקסוזומים, ראשית, קצרו את החומר העל-טבעי או החומר המותנה מתרבית תאים מעניינת. המדיה המותנית תכיל אקסוזומים, חלבונים, פסולת תאית ושלפוחית.

צנטריפוגה של המדיה כדי לגלול את הפסולת התאית. אספו את הסופרנטנט המכיל אקסוזום וסננו אותו דרך מסננות תאים כדי להסיר את השלפוחיות הגדולות יותר. העבר נפח ספציפי של המדיה המסוננת לצינור טרי. לאחר מכן, מערבבים ריכוזים מתאימים של סוכרוז ותחמוצת דאוטריום להכנת כרית סוכרוז - שיפוע לא רציף של סוכרוז.

הוסף נפח ספציפי של תמיסת כרית הסוכרוז לתוך הצינור המכיל מדיה; התמיסה יוצרת שכבה נפרדת בתחתית. כעת, צנטריפוגה את הצינור במהירות גבוהה. כרית הסוכרוז מקלה על נדידת האקסוזומים מהמדיה לתמיסת הסוכרוז תוך שמירה על שלמות האקסוזום. מזהמי החלבון בצפיפות גבוהה תופסים את הממשק בין תמיסת הסוכרוז למדיה.

העבירו בזהירות את החלק העיקרי של שכבת הסוכרוז המכילה אקסוזום לתוך צינור טרי עם מאגר מתאים. צנטריפוגה במהירות גבוהה להשגת כדור של אקסוזומים מטוהרים. השליכו את הסופרנטנט המכיל סוכרוז יחד עם כל מזהמי החלבון. השעו מחדש את גלולת האקסוזום במאגר ואחסנו בטמפרטורות נמוכות עד לשימוש נוסף.

כדי לנקות מראש את המדיום המותנה שנאסף, צנטריפוגה אותו ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש והשליכו את הגלולה. לאחר שחזרתם על שלב הצנטריפוגה הזה עם הסופרנטנט שהתאושש, החזירו את הסופרנטנט שוב והשליכו את הגלולה.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הסופרנטנט המשוחזר ב-2,000 x גרם למשך 15 דקות ו-4 מעלות צלזיוס. שמור את הסופרנטנט והשליך את הגלולה. סנן את הסופרנטנט פעם אחת דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר המחובר למזרק של 20 מיליליטר לתוך צינור צנטריפוגה טרי.

בינתיים, להכנת תמיסת סוכרוז 25% בתחמוצת דאוטריום, שקלו במדויק 1.9 גרם סוכרוז בצינור אוניברסלי. לאחר מכן, הוסיפו תחמוצת דאוטריום עד שהמשקל מגיע ל-7.6 גרם. לאחר מכן, מלאו צינור אולטרה-צנטריפוגה ב-22.5 מיליליטר של מדיום ממוזג שנוקה מראש.

הניחו פיפטה מזכוכית בצינור. הוסף 3 מיליליטר תמיסת סוכרוז דרך הפיפטה כך שהתמיסה תיצור שכבה נפרדת מתחת למדיום הממוזג. הנח בזהירות את הצינור המכיל תמיסת סוכרוז בינונית מותנית בשכבות לתוך הדלי של רוטור מתנדנד החוצה.

אבטח את הדלי לתוך הרוטור. הכנס את הרוטור לתוך האולטרה-צנטריפוגה וסובב אותו 100,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות. אוספים 2 מיליליטר משכבת הסוכרוז מהצינור, 1 מיליליטר בכל פעם, בעזרת פיפטה P1000 עם קצהו מחובר לקצה של 10 מיקרוליטר ומוסיפים אותו לבקבוק אולטרה-צנטריפוגה המכיל 20 מיליליטר PBS מסונן לכביסה.

הנח את הצינור לתוך רוטור בעל זווית קבועה וצנטריפוגה אותו ב-100,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות. השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להסיר בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה עם 400 מיקרוליטר PBS מסונן.

09:22

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:18

בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:03

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:43

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

סרטונים קשורים

0 צפיות

04:27

טיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות: טכניקה לטיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות

סרטונים קשורים

0 צפיות

11:38

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:59

העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:59

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

סרטונים קשורים

0 צפיות

06:27

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

סרטונים קשורים

0 צפיות

05:13

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

סרטונים קשורים

0 צפיות

עודכן לאחרונה: 1 אוגוסט 2026