אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:04 דק׳ • April 30th, 2023
אקסוזומים - שלפוחיות ממברנה בגודל ננו, שמקורן בתאים - מציגים פוטנציאל ככלי אספקה טיפוליים עבור RNA או siRNA מפריע קטן דו-גדילי.
לאחר השחרור לציטופלזמה של תא המטרה, siRNA נקשר לקומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA. לאחר מכן, הקומפלקס המופעל מזהה ונקשר ל-mRNA ספציפי, מווסת באופן שלילי את ביטויו ומתווך השתקת גנים.
כדי לעטוף את siRNA באקסוזומים, ראשית, יש לקרר קובטה אלקטרופורציה על קרח. לאחר מכן, מערבבים אקסוזומים ו-siRNA ספציפי בשפופרת ביחס הרצוי באמצעות מאגר אלקטרופורציה מתאים. כעת, העבירו את התערובת הזו לקובט המצוננת מראש.
סגור את הקובט והנח אותו במחזיק הקובט של האלקטרופורטור. סובב את הגלגל המסתובב כדי להבטיח שהקובטה יוצרת מגע עם אלקטרודות האלקטרופורציה. כעת, הפעל את תוכנית האלקטרופורציה שנבחרה.
במהלך האלקטרופורציה, הפולסים החשמליים מפריעים לשכבת הפוספוליפידים הדו-שכבתית של האקסוזומים התלויים במאגר המוליך. התוצאה היא היווצרות נקבוביות חולפות בקרום האקסוזום, מה שמקדם את הדיפוזיה של siRNA לתוך השלפוחית. המאגר מסייע במניעת צבירת siRNA.
לאחר השלמת האלקטרופורציה, הנקבוביות נאטמות מחדש, ולוכדות את ה-siRNA בפנים. לבסוף, הוציאו את הקובטה מהאלקטרופורטור והעבירו את התערובת לצינור טרי. אחסן את האקסוזומים העטופים ב-siRNA בטמפרטורות נמוכות עד לשימוש נוסף.
לפני תחילת האלקטרופורציה, יש לקרר מראש את קוביית האלקטרופורציה על קרח למשך 30 דקות. מערבבים 7 מיקרוגרם של אקסוזומים עם 0.33 מיקרוגרם של siRNA בצינור המיקרו-צנטריפוגה. הוסף מאגר חומצת לימון כדי להשיג נפח של 150 מיקרוליטר. מוסיפים את תערובת האקסוזום-siRNA לקוביית האלקטרופורציה בעזרת פיפטה מפלסטיק ומכסים את הקובטה.
הנח את הקובט בכיוון הנכון במחזיק הקובטה של האלקטרופורטור וסובב את הגלגל המסתובב של האלקטרופורטור 180 מעלות בכיוון השעון. בחר את התוכנית הרצויה ולחץ על כפתור התחל כדי להתחיל באלקטרופורציה. התצוגה תצביע על דופק מוצלח.
לאחר מכן, סובב את הגלגל לאחור 180 מעלות נגד כיוון השעון והסר את הקובטה. השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להסיר את הדגימה מהקובטה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. שמור את הצינור על קרח או במקרר לפני עיבוד נוסף אם לא נעשה בו שימוש מיידי.