ניתוח ביטוי חלבונים מבוסס מערכי שלב הפוך: הליך לכימות סימולטני של ביטוי חלבונים מרובים מליזט התא

דגימת גידול מכילה אוכלוסייה הטרוגנית של חלבונים. באמצעות ליזאט גידול, ניתן לנתח מספר חלבונים כאלה במקביל כדי לזהות את החלבון המעניין. טכניקה זו בעלת תפוקה גבוהה נקראת מערכי חלבון שלב הפוך או RPPA.

כדי לבצע RPPA, התחל בלקיחת שקופית זכוכית חיסונית מצופה בניטרוצלולוז. הבחין במערך של חלבוני ליזאט גידול בשקופית. דגירה כדי לאפשר לכידת חלבון על ניטרוצלולוז. לאחר מכן, טפל בשקופית עם מאגר חוסם החוסם אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים על חלבונים.

הסר את תמיסת החסימה העודפת. כעת, הרכיבו את השקופית המצופה חלבון במחזיק ואטמו אותה היטב. זה יוצר בארות זמניות מעל משטח המגלשה. לאחר מכן, טען את הבארות בתמיסת נוגדנים ראשונית. נוגדנים אלה מזהים אפיטופים הקיימים על המטרה המתאימה מתערובת של חלבונים במערך.

לבסוף, הוסף נוגדנים משניים עם תווית פלואורסצנטית. נוגדנים אלה נצמדים לנוגדנים הראשוניים הקשורים מראש ויוצרים קומפלקס. שטפו את השקופית כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים. שחרר את השקופית מהמחזיק ואפשר לה להתייבש באוויר.

סרוק את השקופית באמצעות סורק פלורסנט. חלבוני המטרה המתויגים על ידי נוגדנים זוהרים באורך גל מסוים ומופיעים ככתמים צבעוניים על משטח המגלשה.

לפני הדפסת RPPA, סדרה של חמישה דילולים כפולים נעשית מכל דגימה. אחד ההיבטים הגוזלים ביותר של הליך זה הוא ביצוע מאות דילול. ניתן להבטיח תוצאה מוצלחת על-ידי