JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 4:18 דק' • April 30th, 2023
מיקרו-הזרקה תוך ורידית מקלה על העברת מולקולות מעניינות לזרם הדם של בעל חיים מקבל. כדי להעביר נפרוטוקסינים לעובר דג זברה, ראשית, הכינו ריכוז מתאים של תמיסת נפרוטוקסין רצויה.
בעזרת קצה טעינת ג'ל עדין, טען את תמיסת הנפרוטוקסין הזו למחט מיקרו-הזרקה עם קצה זוויתי מחודד. השעו את המחט אנכית כדי לאפשר לתמיסת הנפרוטוקסין למלא את קצה המחט על ידי כוח הכבידה. כעת, אבטח את מחט המיקרו-הזרקה הטעונה למחזיק של מיקרומניפולטור.
לאחר מכן, העבירו עובר דג זברה מורדם לתבנית המיקרו-הזרקה טרומית. יישר את העובר בתבנית כשראשו מכוון בתוך הבאר והזנב החוצה מהבאר, ומשפר את הנגישות לזנב לצורך מיקרו-הזרקה. לאחר מכן, מקם במדויק את קצה המחט ליד העובר.
הזרקו את תמיסת הנפרוטוקסין לווריד הזנב של העובר. החומרים הנפרוטוקסיים המוזרקים מתפשטים במחזור הדם ומגיעים לאיברים מרוחקים כמו הכליה. משוך בעדינות את המחט. העבירו את העובר לכלי טרי המכיל מדיה עוברית ואפשרו לו להתאושש. דגירה על העובר למשך זמן מסוים.
תוך שעות מההזרקה, הנפרוטוקסינים מצטברים בכליה וגורמים לנזק, מה שמוביל לירידה בתפקוד הכליות.
ביום ההזרקה, הכינו את תמיסת הנפרוטוקסין הרצויה עם בקרת הרכב המתאימה. מערבולת או מערבבים אותו בעדינות. לאחר מכן, בדוק את דפנות הצינור ואת החלק העליון של עמוד המים כדי לוודא שהתרופות מומסות בתמיסה.
טען מחט מיקרו-הזרקה גזומה עם 2 עד 3 מיקרוליטר של נפרוטוקסין על ידי השחלת קצה טעינת ג'ל עדין לחלק האחורי של המחט ותלה את המחט אנכית עם פיסת סרט כדי לאפשר לתמיסה למלא את קצה המחט הגזוז בכוח הכבידה.
לאחר שקצה המחט מלא, אבטח את המחט הטעונה לתוך המיקרומניפולטור. בדוק את נפח המיקרו-הזרקה על ידי הנחת טיפת שמן מינרלי על שקופית מיקרומטר והזרקה לתוך השמן כדי להעריך את גודל הטיפה.
לאחר מכן, הוציאו את צלחת העוברים מהחממה והרדימו אותם על ידי הוספת 5 מיליליטר של 0.2% טריקאין לצלחת העובר. לאחר מכן, העבירו את העוברים לתבנית ההזרקה בעזרת פיפטת העברה. תמרנו כל עובר לבאר אחרת של התבנית, והניחו את הראש באזור העמוק ביותר של הבאר כך שתא המטען מונח לאורך השקע והזנב בולט ממנו.
כעת, הכנס את המחט המלאה למיקרומניפולטור ומקם את קצה המחט ליד עובר. הכנס בעדינות את המחט לווריד הזנב למיקרו-הזרקה.
השלב הקריטי ביותר בהליך הוא המיקרו-הזרקה. כדי להבטיח הצלחה, יש לחתוך את המחט בזווית חדה ולהזיז אותה בזהירות למקומה ליד העובר.
אם ההזרקה מצליחה, אתה אמור לראות את הנוזל נכנס למחזור הדם. הזרקה משותפת של החומר הנפרוטוקסי עם דקסטרן מצומד פלואורסצנטי תאפשר לחוקר לוודא הזרקה מוצלחת לאחר ההליך. לאחר מכן, הסר בעדינות את המחט מהעובר.
העבירו את העובר לכלי נקי ושטפו כדי להסיר את הטריקאין עם E3/PTU טרי. לאחר מכן, דגרו את העובר לנקודת הזמן הרצויה כדי להעריך את המורפולוגיה, אותה ניתן לתעד על ידי צילום באמצעי הרכבה של מתיל צלולוז, או תהליך לניתוח ניסיוני כרצונכם.
שימו לב כי יש להעריך את התאוששות העוברים כל 12 עד 24 שעות לאחר ההזרקה כדי לקבוע את אחוז האנשים הסובלים מבצקת, מה שמעיד בדרך כלל על פגיעה בכליות.