$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פתולוגיה של התפשטות, או ExPath, היא טכניקת הכנת דגימה לדגימות ביולוגיות, המאפשרת מיקרוסקופ אור קונבנציונלי לדמות מבנים בקנה מידה ננומטרי על ידי הרחבתם באמצעות מערכת פולימרים.
ראשית, קח שקופית דגימת רקמה מעובדת מוכתמת חיסון וכסה אותה בתמיסת עיגון המכילה קבוצות חלבון ופולימרים כאחד. הקבוצה המגיבה לחלבון של מגיב העיגון נקשרת לאמינים של ביומולקולות בתוך התאים.
לאחר מכן, הוסיפו תמיסת ג'ל מתאימה מעל הדגימה ודגרו כדי לאפשר את דיפוזיה בתוך הרקמה. הקבוצה המגיבה לפולימר של מגיב העיגון נקשרת למונומרים החופשיים בתוך תמיסת הג'ל, ומאפשרת לביו-מולקולות לעגן לפולימר כשהוא מתפלמר.
לאחר השלמת פילמור הדגימה, כסו את השקופית בתמיסת פרוטאינאז. חלבונים מעכלים חלבוני שלד כדי להסיר כל התנגדות מבנית, ומאפשרים לתאים להתרחב מבלי להיקרע. עם עיכול אנזימטי, דגימת הג'ל מתנתקת מהמגלשה ועוברת לתרחיף.
כעת, העבירו את הדגימה למאגר כביסה מתאים במיכל תואם מיקרוסקופ. לאחר מכן, החלף את המאגר במים ודגירה. הפולימר סופג כמות עצומה של מים ביחס למסתו ומתנפח.
ככל שהפולימר מתרחב, הביו-מולקולות המעוגנות לרשת הפולימרים מתרחקות זו מזו תוך שמירה על האוריינטציה המרחבית שלהן. זה מאפשר הדמיה קלה שלהם תחת מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי.
הכנת תמיסת עיגון לפי הוראות כתב היד. מניחים את המגלשות בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר. פיפטו את תמיסת העיגון מעל הרקמה ודגרו עליהם לפחות 3 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תמיסת ג'ל לפי הוראות כתב היד.
הסר תמיסת עיגון עודפת מחלק הרקמה והנח את המגלשה בחזרה לתוך צלחת הפטרי. מוסיפים לדגימה תמיסת ג'ל קרה טרייה ומדגרים את התערובת למשך 30 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. כדי לבנות תא על המגלשה סביב הדגימה, צור מרווחים על ידי חיתוך דק של חתיכות זכוכית כיסוי בעזרת סכין יהלום. אבטח את המרווחים משני צידי הטישו במים והנח בזהירות מכסה זכוכית כיסוי מעל המגלשה, הקפד להימנע מלכידת בועות אוויר מעל הרקמה.
לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה למשך שעתיים. הסר את מכסה תא הג'ל על ידי החלקה עדינה של סכין גילוח מתחת לכיסוי והרמתו לאט ממשטח הג'ל. חתוך את הג'ל הריק סביב הרקמה כדי למזער את הנפח, הקפד לחתוך את הג'ל בצורה אסימטרית כדי לעקוב אחר הכיוון.
יש לדלל את Proteinase K 1:200 במאגר העיכול, ולהקפיד להכין מספיק תמיסה כדי לטבול לחלוטין את הג'ל. לאחר מכן, דגרו את הדגימה עם התמיסה במיכל סגור למשך 3 שעות בחום של 60 מעלות צלזיוס. אם הדגימה לא מתנתקת במהלך העיכול, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר אותה בעדינות.
השתמש במברשת צבע רכה כדי להעביר את הדגימה ל-1X PBS במיכל התואם למערכת ההדמיה הרצויה וגדול מספיק כדי להכיל את הג'ל המורחב במלואו. שטפו את הדגימה ב-PBS למשך 10 דקות, ואם תרצו, צבעו אותה מחדש עם DAPI של 300 מילי-מולאר. הרחב את הדגימות על ידי שטיפת הדגימה בנפח עודף של מים מזוקקים כפולים 3 עד 5 פעמים למשך 10 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, בצע הדמיה פלואורסצנטית.