שאיפת נוזל מגלומרולי עכבר: שיטה לשאיפת נוזל גלומרולרי מעכבר באמצעות מיקרופונקטורה בתיווך שני פוטונים

בכליה, הגלומרולוס - צרור של כלי דם קטנים הסגורים בקפסולה של באומן - יוזם סינון דם ומוציא את נוזל הפסולת לחלל של באומן שמסביב. חקירת תכולת הנוזל הגלומרולרי מסייעת בהבנת הפיזיולוגיה של הכליות.

כדי לשאוב את הנוזל הגלומרולרי, הכינו עכבר מורדם עם הכליה שלו בניתוח. כעת, הזריקו צבע פלואורסצנטי-דקסטרן לכלי הדם שמאחורי מסלול העין של העכבר. מולקולות פלואורסצנטיות-דקסטרניות נעות בזרם הדם ומגיעות לכליה.

בשל משקלו המולקולרי הגבוה של הדקסטרן, הצבע הפלואורסצנטי נשמר בתוך הגלומרולוס, ומעניק לו צבע ירוק. תחת מיקרוסקופ דו-פוטוני, המאפשר הדמיה של מבנים יושבים עמוק, אתר גלומרולוס מתאים כדי לקבל גישה נאותה לנוזל הגלומרולרי.

לאחר מכן, יישר קצה מיקרופיפטה מצופה ננו-חלקיקים פלואורסצנטי אדום עם הציר הצדדי של הכליה. בעזרת מיקרומניפולטור, קדם את קצה הפיפטה כדי לחדור לכליה. כאשר הקצה מגיע לגלומרולוס המטרה, הגדר את קצב השאיפה הרצוי כדי לשאוב את הנוזל הגלומרולרי מהחלל של באומן.

היעדר פלואורסצנטיות ירוקה בתוך קצה הפיפטה האדומה מעיד על חוסר דימום ומאשר שאיבת נוזל גלומרולרי מוצלחת. לאחר מכן, החזר את הפיפטה ואחסן את הנוזל במאגר מתאים להמשך ניתוח.

לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן, מרחו משחה על העיניים והשתמשו בנייר דבק כדי לשתק את הגפיים של עכבר בוגר במשקל 20 עד 25 גרם. השתמש בקרם אפילציה כדי להסיר את כל השיער בצד שמאל של החיה, והשתמש בטחול כדי לאתר את הכליה השמאלית דרך העור בצד הגבי והזנב של הטחול.

בצע חתך של 0.5 סנטימטר בעור, ואחריו חתך קטן יותר בצפק, גדול מספיק כדי לדחוף את הכליה. הוצא את הכליה בלחץ עדין והניח סביב הרקמה מייצב כליות פוליסילוקסן. יישר את הכליה עם הספייסר כך שהמשטח הצדדי ביותר של הכליה משתרע מעבר למייצב בכמילימטר אחד וקבע את הכליה לצורה עם דבק ציאנואקרילט. הדביקו לוחית ראש לצורת המייצב והרכיבו את לוחית הראש על מוטות הרכבה על לוחית הבסיס.

לאחר מכן, מלאו את הבאר בתמיכת הפוליסילוקסן בתמיסת אגרוז של 1% והחזיקו כיסוי של 10 מילימטר על גבי הטופס עד שהאגרוז יציב. אטום את הכיסוי לצלחת הראש בעזרת דבק וצור טבעת סביב הכיסוי בעזרת מלט שיניים. לאחר מכן, הזרקו 100 עד 150 מיקרוליטר של FITC-dextern רטרו-אורביטלי והעבירו במהירות את העכבר ואת לוחית הקיבוע לשלב המיקרוסקופ הדו-פוטוני.

לאחר התמקדות ידנית במשטח הכליה, עבור למצב דו-פוטוני ללא סריקה וחקור את חלון ההדמיה כדי לאתר גלומרולוס מטרה הגדול מ-30 מיקרומטר מתחת לכיסוי ופחות מ-400 מיקרומטר מקפסולת הכליה הרוחבית. רשום את המרחק הרוחבי והאנכי לגלומרולוס המטרה. לאחר מכן, רשום את קואורדינטות השלב x, y ו-z עבור הגלומרולוס, ולבסוף, העלה את נקודת המוקד האובייקטיבית כמילימטר אחד לתוך עמודת המים מבלי לשנות את קואורדינטות שלב x ו-y.

הכניסו את קצה הפיפטה לתוך עמוד המים והפעילו את עירור ה-DAPI. הזז את הפיפטה במידות X ו-Y עד לנקודת הקרינה המקסימלית של הקצה. זה יהיה מרכז המטרה. שנה את הגדרת העירור לחלבון פלואורסצנטי אדום ודמיין את הפיפטה עם העין כדי לאפשר ריכוז מדויק במבט העין.

חזור לשני פוטונים כדי למצוא את הפיפטה מתחת לתצוגת שני הפוטונים החיה ולמקם את הקצה בדיוק במרכז התמונה. זוהי עמדת הרישום. לאחר מכן, שמרו תמונה של הפיפטה ורשמו את השלב ואת הקואורדינטות של בקר המיקרופיפטה. הסר את הפיפטה מעמוד המים בציר ה-x מבלי להזיז את צירי y ו-z, והעבר את הפיפטה Z לקואורדינטת המטרה גלומרולוס Z ולקצה הכליה.

שימו לב לשלב X וחשבו את פיפטת קצה הכליה X באמצעות ההיסט משלב הרישום, X. הגדילו את שלב X כדי להזיז את השלב לכיוון הפיפטה עד שקצה הכליה נמצא הרחק משמאל למסך תוך שהוא נשאר גלוי. קדם במהירות את הפיפטה למרחק של כ-100 מיקרומטר מקצה הכליה פיפטה X כפי שחושב זה עתה. הגדל את הרווח האדום והתחל לקדם את קצה הפיפטה לאט לקצה הכליה תחת הדמיה חיה של שני פוטונים תוך ניטור היסטוגרמה של הפיקסלים האדומים.

הניעו את הפיפטה בציר ה-x באיטיות אל פיפטת המטרה הגלומרולוס X, תוך שמירה על שלב X. כשתגיע לגלומרולוס, תעד את המיקום עם ערימת Z. כשהפיפטה במקומה, הגדר את המיקרו-משאבה להזריק 100 ננוליטר של פרפלואורודקלין במשך 2 דקות כדי להבטיח סבלנות של הפיפטה ולהפחית את הבלבול מסתימת הפיפטה במהלך הכניסה. לאחר 4 עד 6 דקות של סינון, הגדר את המיקרו-משאבה לשאוב עד 300 ננוליטר בקצב של עד 50 ננוליטר לדקה.