מודל תאי גזע גליומה מתויג לוציפראז: שיטה בתיווך לנטיוירוס להכנת תאי גזע גליומה מתויגים לוציפראז למחקרים טיפוליים במבחנה

תאי גזע גליומה או GSCs הם תת-אוכלוסייה של גליומה - סרטן של תאי גליה במוח.

תיוג GSCs אלה עם אנזימים ביולומינסנטים כמו לוציפראז עוזר לבסס מבחני הדמיה בתפוקה גבוהה לבדיקת תרופות.

כדי להכין GSCs מתויגים לוציפראז, התחל בתרבית של GSCs במצע גידול מתאים.

צנטריפוגה את התרבית כדי להשיג כדור תא ולהסיר את הסופרנטנט.

הוסף אנזימי עיכול מתאימים לגלולה. אנזימים אלה מפרקים אשכולות תאים ומפרקים כל עקבות של רקמת חיבור כדי להשיג תרחיף של תא בודד.

כעת, צנטריפוגה את התרחיף החד-תאי והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה במדיום רענן.

לאחר מכן, זרעו את הריכוז הרצוי של התאים בצלחת תרבות.

דגרו את התרבות ואפשרו לתאים להיצמד לצלחת התרבות.

לאחר מכן, הוסף את הטיטר הרצוי של מבנה גן המכיל וירוס עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר בלוציפראז או EGFP ודגירה.

הנגיף מקיים אינטראקציה עם קולטני פני השטח של GSCs, ומפעיל שחרור של RNA ויראלי המכיל לוציפראז-EGFP. אנזימים תאיים מזרזים שעתוק הפוך של RNA ל-DNA דו-גדילי ומשלבים אותו בגנום של GSCs.

כאשר מדמיינים אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תאים המבטאים לוציפראז נראים ירוקים עקב הקרינה הנפלטת על ידי EGFP.

התחל באיסוף תאי הגזע של הגליומה או GSCs ממדיום התרבית וצנטריפוגה שלהם ב-70 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופרנטנט, עכל את התאים עם אקוטאז למשך 4 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

בעזרת קצה של 200 מיקרוליטר, פיפטה את התאים שוב ושוב כדי לנתק ולהשעות מחדש את כדור התא. הוסף את ה-GSCs בצפיפות של 200,000 תאים ב-1 מיליליטר של מדיום תרבית לכל באר של צלחת תרבית של 12 בארות ודגר אותם למשך הלילה.

למחרת, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של נגיף לוציפראז-EGFP לכל באר בצלחת. צנטריפוגה של התאים ב-1,000 x גרם למשך שעתיים ב-25 מעלות צלזיוס ודגירה עליהם למשך הלילה.

למחרת, החלף את המדיום בבארות על ידי איסוף ה-GSCs, צנטריפוגה, הוצאת הסופרנטנט, השעיית אותם מחדש במדיום טרי וציפוי מחדש. תרבית התאים למשך 48 שעות נוספות.

התבונן בצלחת תחת מיקרוסקופ פלורסנט ואשר את הופעתם של תאים חיוביים ל-GFP.