מיצוי מבוסס אימונוזיקה של פפטידים יוביקוויטינילטים: טכניקה לחילוץ סלקטיבי של פפטידים מתויגים של יוביקוויטין משברי פפטידים מטוהרים

אוביקוויטינציה של חלבונים מאופיינת בתוספת של יוביקוויטין - מיני חלבון רגולטורי - דרך שאריות הדי-גליצין שלו לשאריות הליזין של חלבון הסובסטרט. זה יוצר קישור ליזין-גליצין-גליצין בין חלבון הסובסטרט ליוביקוויטין.

כדי לבודד פפטידים מתויגים ביוביקוויטין, התחילו בנטילת תערובת פפטידים.

טפל בפפטידים אלה עם קוקטייל אנזים אנדונוקלאז. במהלך הטיפול, האנזימים Lys-C וטריפסין מבקעים ביעילות את הפפטידים היוביקוויטיניים בשאריות הארגינין, וכתוצאה מכך שברי פפטידים המכילים מוטיב די-גליצין חתימה.

הוסף את שברי הפפטידים הללו לתרחיץ של חרוזי הידרוג'ל מצומדים לנוגדנים.

נוגדנים אלה מכילים אתר זיהוי די-גליצין, הנקשר אך ורק לפפטידים האוביקוויטיניליים, ויוצר קומפלקס פפטיד-חרוזים.

צנטריפוגה לגלולה של קומפלקסים של פפטיד-חרוזים עם אוביקוויטיניל. הסר את הסופרנטנט הלא קשור המכיל פפטיד שאינו אוביקוויטיניל.

טען את המתחמים על מכלול פילטר. צנטריפוגה להסרת המאגר ולכידת חרוזים מצומדים לפפטיד.

הוסף מגיב מחומצן שמוריד את ה-pH, וגורם לניתוק של פפטידים מהחרוזים.

שחזר את הפפטידים החופשיים מהמסנן. טען אותם על פילטר טרי עם מטריצה הידרופובית. הפפטידים נשמרים במטריקס בעוד מלחים חומציים נשטפים.

בעזרת ממס מתאים, נתק את הפפטידים.

העבירו את הפפטידים האוביקוויטיניליים לצינור טרי וייבשו אותם כדי להסיר עקבות של ממס.

אצווה אחת של נוגדנים ל