מיצוי מבוסס SDS-PAGE של חלבונים הקשורים לשלפוחיות חוץ-תאיות: הליך למיצוי חלבונים מכלי רכב חשמליים והכנתם לעיכול בג'ל
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:22 דק׳ • April 30th, 2023
כדי להתחיל, קח צינור המכיל שלפוחיות חוץ-תאיות שלמות או EVs.
השעו את ה-EVs בנפח הרצוי של מאגר הליזיס ועשו סוניקציה של הדגימה. טיפול זה מבצע ליזה של קרום EV וגוזז את החומר הגנטי, ומשחרר את החלבונים לתוך המאגר.
צנטריפוגה לכדורי פסולת התאים והחומר הגנטי הגזוז. אסוף את הסופרנטנט המכיל חלבונים שונים.
הוסף צבע טעינה לתמצית החלבון והעביר אותו על ג'ל SDS-PAGE.
השרו את הג'ל בתמיסת צביעה כדי לאפשר למולקולות הצבע לקשור חלבונים. אתר את הרצועה המוכתמת המכילה את החלבון הרצוי והוציא אותה.
חותכים את הרצועה הצבעונית לחתיכות קטנות כדי לשפר את הנגישות של חלבונים לאנזימים בשלבים הבאים. העבירו את החלקים הללו לצינור מיקרו-צנטריפוגה.
הוסף תמיסת מעכב המסירה את צבע הצביעה. הסר את תמיסת ההימנעות המושקעת.
הוסף פתרון הפחתה. דגירה כדי לאפשר לחומר המפחית לבקע את קשרי הדיסולפיד בחלבון, ולחשוף את קבוצות הסולפידריל החופשיות.
טפל בחלבונים המופחתים בתמיסת אלקילציה. קבוצות האלקיל נקשרות לקבוצות הסולפידריל החופשיות, ושומרות על החלבון פתוח.
השליכו את התמיסה העודפת ושטפו את החלקים בתמיסה מייבשת, כדי להסיר את המגיב האלקילטי. יבש את הג'ל לחלוטין.
חתיכות ג'ל מוכנות כעת לניתוח פרוטאומי נוסף.
למיצוי חלבון, מערבבים 50 מיקרוליטר של מאגר RIPA עם דגימת EV למשך 5 דקות על קרח. סוניקציה של הדגימה שלוש פעמים ב-500 וואט ו-20 קילו-הרץ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים