אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:22 דק׳ • April 30th, 2023
כדי להתחיל, קח צינור המכיל שלפוחיות חוץ-תאיות שלמות או EVs.
השעו את ה-EVs בנפח הרצוי של מאגר הליזיס ועשו סוניקציה של הדגימה. טיפול זה מבצע ליזה של קרום EV וגוזז את החומר הגנטי, ומשחרר את החלבונים לתוך המאגר.
צנטריפוגה לכדורי פסולת התאים והחומר הגנטי הגזוז. אסוף את הסופרנטנט המכיל חלבונים שונים.
הוסף צבע טעינה לתמצית החלבון והעביר אותו על ג'ל SDS-PAGE.
השרו את הג'ל בתמיסת צביעה כדי לאפשר למולקולות הצבע לקשור חלבונים. אתר את הרצועה המוכתמת המכילה את החלבון הרצוי והוציא אותה.
חותכים את הרצועה הצבעונית לחתיכות קטנות כדי לשפר את הנגישות של חלבונים לאנזימים בשלבים הבאים. העבירו את החלקים הללו לצינור מיקרו-צנטריפוגה.
הוסף תמיסת מעכב המסירה את צבע הצביעה. הסר את תמיסת ההימנעות המושקעת.
הוסף פתרון הפחתה. דגירה כדי לאפשר לחומר המפחית לבקע את קשרי הדיסולפיד בחלבון, ולחשוף את קבוצות הסולפידריל החופשיות.
טפל בחלבונים המופחתים בתמיסת אלקילציה. קבוצות האלקיל נקשרות לקבוצות הסולפידריל החופשיות, ושומרות על החלבון פתוח.
השליכו את התמיסה העודפת ושטפו את החלקים בתמיסה מייבשת, כדי להסיר את המגיב האלקילטי. יבש את הג'ל לחלוטין.
חתיכות ג'ל מוכנות כעת לניתוח פרוטאומי נוסף.
למיצוי חלבון, מערבבים 50 מיקרוליטר של מאגר RIPA עם דגימת EV למשך 5 דקות על קרח. סוניקציה של הדגימה שלוש פעמים ב-500 וואט ו-20 קילו-הרץ למשך 5 שניות. לאחר מכן, הסר פסולת שלפוחית על ידי צנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
לאחר בידוד החלבונים, בצע נדידת חלבון בג'ל הערימה של ג'ל פוליאקרילאמיד 12%. תקן את החלבונים בג'ל עם Coomassie blue למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, כורתים כל חתיכת ג'ל צבעונית וחותכים אותה לחתיכות קטנות.
הכניסו את חתיכות הג'ל לסדרה של שטיפות עוקבות כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, יבש אותם לחלוטין עם רכז ואקום. לאחר הייבוש, בצע הפחתת חלבון עם 100 מיקרוליטר אמוניום ביקרבונט 100 מילי-מולרי המכיל 10 מילי-מולרי דיתיותרייטול למשך שעה אחת ב-56 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, בצע אלקילציה של חלבון עם 100 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 100 מילי-מולרי המכיל 50 מילי-מולרי יודואצטמיד למשך 45 דקות בחושך. שוטפים את נתחי הג'ל לפי הוראות כתב היד ומייבשים אותם לחלוטין על רכז הוואקום.