בדיקת סינתזת DNA: טכניקה להערכת סינתזת DNA בתאים מתרבים באמצעות שילוב תימידין טריטיאט רדיואקטיבי

התחל בנטילת צלחת מרובת בארות המכילה תאים דבקים.

טפל בתאים אלה בחומר המכיל תימידין טריטי - גרסה רדיואקטיבית של תימידין - ודגר.

במהלך הדגירה, תאים המשכפלים באופן פעיל משלבים תימידין רדיואקטיבי. תימידין זה מתחבר מול אדנוזין, ויוצר DNA עם תווית רדיו בתאים מתרבים.

הסר את המדיה המבוזבזת מבארות. הוסף מאגר ליזה כדי לשחרר את התאים ולשחרר DNA לתוך התרחיף.

הכן את מכלול קציר התאים על ידי הנחת צינורות האיסוף של הקציר מעל בארות המיקרופלייט.

הפעל לחץ יניקה כדי לאפשר שאיבת DNA מרחף מהבארות. DNA זה משקע על נייר הסינון ויוצר כתמים ספציפיים.

גזרו את צ'אדי נייר הסינון עם כתמי DNA. העבירו את הצ'אדים הללו בנפרד לבקבוקוני נצנוץ.

שכבו את נייר הסינון עם קוקטייל נצנוץ. הנח את הבקבוקון בדלפק נצנוץ נוזלי.

בתוך הדלפק, ה-DNA המסומן פולט אנרגיה על ידי דעיכה רדיואקטיבית. אנרגיה זו נספגת במרכיבי קוקטייל הנצנוץ. בסופו של דבר, רכיבי הקוקטייל מתחילים להעביר את הפולסים, אשר בתורם נספגים על ידי החיישן.

כמות הרדיואקטיביות שזוהתה קובעת את מידת חלוקת התאים.

צלחת 100,000 תאים בבארות משולשות בצלחת של 24 בארות. לאחר 46 שעות, הוסיפו תימידין טריטי למדיום התרבות ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, לאחר הסרת המדיום, הוסיפו 300 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-EDTA שחומם מראש ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לפרק את התאים ולשחרר את ה-DNA. לאחר מכן, הפעל את קציר התאים והפעל.

הנח את נייר הסינון בקציר התאים. המשך לאסוף את הצינורות של קציר התאים במגש ריק ריק. לאחר מכן, לחץ על כביסה מוקדמת כדי להרטיב את נייר המסנן. הניחו את צינורות האיסוף בבארות דגימה והתחילו.

השתמש במקור אור חם כדי לייבש את נייר הסינון ולסדר בקבוקונים מתאימים על המגש. מחוררים צ'אדים מנייר לתוך הבקבוקונים ואז מוסיפים 2 מיליליטר קוקטייל נצנוץ נוזלי לכל בקבוקון.

דגרו את הבקבוקונים למשך שעה אחת במונה הנצנוץ לפני הפעלת המכונה כדי לקבל את הספירה לדקה של כל דגימה, המשקפת את סינתזת ה-DNA הפעילה.