אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 4:02 דק׳ • April 30th, 2023
נוירוספרות הן אגרגטים כדוריים שאינם דבקים של תאי מבשר עצביים או NPCs.
כאשר הם מצופים בתנאי תרבית דבקים ספציפיים, NPCs עשויים לנדוד באופן ספונטני החוצה מהנוירוספרה.
כדי להעריך את תגובת הנדידה של NPCs, ראשית, הכינו תרחיף NPC בצפיפות הרצויה במדיה מתאימה.
לאחר מכן, זרעו את תרחיף התא לתוך צלחת תרבית המכילה מדיה ודגרו.
גורמי הגדילה הספציפיים במדיה תומכים בהתפשטות התאים. בנוסף, היעדר מצע ציפוי שומר על התאים תלויים במדיה, מה שמקל עליהם ליצור אגרגטים תלת-ממדיים של תאים הנקראים נוירוספרות.
בהשגת הגודל הרצוי, אסוף את הנוירוספרות.
צנטריפוגה והשעיה מחדש של כדור הנוירוספירה במדיה המדוללת.
לאחר מכן, צלחו את מתלה הנוירוספירה לצלחת מצופה מטריצה חוץ-תאית המכילה מדיה מדוללת ודגירה.
במהלך התרבות, הנוירוספרות נצמדות למטריצה החוץ-תאית.
עם הזמן, בשל מרכיבי המטריצה החוץ-תאית, כמה NPCs מתחילים לנדוד הרחק מליבת הנוירוספרה.
כעת, הסר את המדיה ותקן את התאים.
צלם תמונות ניגודיות פאזה של הנוירוספרות המציגות נדידת תאים.
בעזרת תוכנה מתאימה, מדוד את שטח הנוירוספירה הכוללת ואת מסת התא הפנימית.
לבסוף, הפחיתו את שטח המסה הפנימי של התא מהשטח הכולל של הנוירוספירה כדי לחשב את נדידת ה-NPC הממוצעת מהנוירוספירה.
כדי ליצור את הנוירוספירה, פיפטה 1 מיליליטר של 100% מדיית התפשטות לתוך צלחת של 35 מילימטר ללא כל מצע ציפוי. לאחר מכן, הוסיפו מיליון תאי מבשר עצביים בכל אחת מהלוחות הללו ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 עד 96 שעות.
כדי להכין את הצלחת לנדידת נוירוספרה, ממיסים אליקוטים של ג'ל חיקוי ECM ב -6 מיליליטר של מדיום התפשטות של 30%. הוסף 1 מיליליטר של ג'ל מחקה ECM עם מדיום הרחבה של 30% בבאר אחת של צלחת של 6 בארות. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
כדי לצלחת הנוירוספרות השתמש בפיפטה כדי לאסוף את התאים בתווך מהצלחת של 35 מילימטר ולהעביר אותם לצינור חרוטי. לאחר מכן, סובב את הצינור ב-100 x g כדי לגלול את הנוירוספרות. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-1 עד 3 מיליליטר של מדיום התפשטות של 30% שחומם מראש.
לאחר מכן, פיפטה 200 מיקרוליטר של הנוירוספרות התלויות לתוך צלחת 6 הבארות המכילה את הג'ל המחקה ECM עם מדיום התפשטות של 30% וטלטל את הצלחת. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. שאפו את הג'ל מחקה ECM עם מדיום התפשטות של 30% ולאחר מכן קבעו את התאים למשך 30 דקות באמצעות 4% פרפורמלדהיד.
כדי לנתח את הנוירוספרות, צלם תמונות באמצעות הגדרות ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 10. השתמש בתוכנת NIH ImageJ כדי למדוד את הנדידה הממוצעת של הנוירוספרות. ב-ImageJ, השתמש בכלי הקו החופשי כדי לעקוב אחר קווי המתאר החיצוניים של הנוירוספירה.
לאחר מכן, השתמש בפונקציית מדידה כדי לחשב את שטח המעקב ולעקוב אחר מסת התא הפנימית של הכדור. הפחיתו את מסת התא הפנימית מאזור הנוירוספירה הכולל כדי לכמת את הנדידה הממוצעת.