בידוד אסטרוציטים: שיטה להשגת הכנה טהורה של אסטרוציטים קורטיקליים של עכבר

האסטרוציטים בתרבית מבחנה מסייעים לחקור את התפקיד הביולוגי של אסטרוציטים - תאי המוח הנפוצים ביותר.

התחילו עם מוח עכבר יילוד המונח תחת מיקרוסקופ מנתח.

הסר את נורות הריח ואת המוח הקטן.

בצע חתך בקו האמצע בין שתי ההמיספרות כדי להפריד את קליפת המוח.

הסר את קרומי המוח כדי למנוע זיהום בתרבית האסטרוציטים מפיברובלסטים ותאי קרום המוח.

העבירו את חצאי קליפת המוח לתווך קר כקרח וטחנו לחתיכות קטנות.

אסוף את החתיכות בקליפת המוח בצינור המכיל טריפסין. טריפסין, אנזים פרוטאז, מעכל את חלבוני הידבקות התאים, ומקל על הפרדת התאים.

צנטריפוגה לכדור הרקמה המעוכלת.

הסר את הסופרנטנט והוסף מדיום אסטרוציטים לגלולה. פיפטה במרץ לשחרר אוכלוסיית תאים מעורבת של אסטרוציטים, מיקרוגליה ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים או OPCs.

זרע את תרחיף התאים הזה לתוך בקבוק תרבית רקמה מצופה פולי-ליזין ודגירה.

התאים הטעונים שלילית מתחברים לפולי-ליזין הטעון חיובית וגדלים על פני כל השטח ליצירת שכבה מתכנסת.

נער את הבקבוק כדי לנתק את המיקרוגליה וה-OPCs הקשורים באופן רופף. הסר את הסופרנטנט המכיל תאים מנותקים.

הוסף טריפסין לשכבת האסטרוציטים. אוספים את התאים והצנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה וחלקו את האסטרוציטים למספר צלוחות.

לבסוף, העריכו את טוהר תרבית האסטרוציטים על ידי צביעה חיסונית של סמנים ספציפיים לתא.

העבירו את הצלחת המכילה את המוח לסטריאומיקרוסקופ. לאחר מכן, כדי לבודד את קליפת המוח, תפסו את הקצה האחורי של כל מוח בעזרת מלקחיים עדינים ובצעו חתך בקו האמצע בין ההמיספרות.

לאחר מכן, הכניסו סט שני של מלקחיים לחריץ שנוצר וקילפו את המבנה דמוי הצלחת של קליפת המוח משאר המוח.

לאחר שכל קליפות המוח בודדו, קלפו בזהירות את קרומי המוח הרחק מקליפת המוח על ידי משיכה בעזרת המלקחיים העדינים. שלב זה מונע זיהום של תרבית האסטרוציטים הסופית על ידי תאי קרום המוח ופיברובלסטים.

מעבירים את חצאי קליפת המוח המוכנים לצלחת שנייה מלאה ב- HBSS צונן ומניחים על קרח. המשיכו בהתאם עם כל ארבעת קליפות המוח. לבסוף, חותכים כל חצי כדור לארבע עד שמונה חתיכות קטנות בעזרת להבים חדים.

בתנאים סטריליים, העבירו את חלקי קליפת המוח לתוך שפופרת פלקון אחת של 50 מיליליטר והוסיפו HBSS לנפח סופי של 22.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 2.5 מיליליטר של 2.5% טריפסין.

החזירו את המכסה, ערבבו ודגרו את הטישו באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מערבבים על ידי ניעור כל 10 דקות. לאחר מכן, לאחר צנטריפוגה של 5 דקות ב-300 x g כדי לגלול את חלקי רקמת קליפת המוח, שפכו בזהירות את הסופרנטנט.

הוסף 10 מיליליטר של מדיום ציפוי אסטרוציטים לגלולה, והשתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לזרוק במרץ את המדיום המכיל את הרקמה למעלה ולמטה 20 עד 30 פעמים עד לקבלת תרחיף תא בודד.

לאחר מכן, הוסף מדיום ציפוי אסטרוציטים לנפח סופי של 20 מיליליטר וספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי על פי נהלים סטנדרטיים.

תכשיר אחד של ארבעה קליפות גור עכבר אמור להניב 10 עד 15 כפול 10 עד שישי תאים בודדים מנותקים. לבסוף, שאפו את הפולי-D-ליזין מבקבוק שהוכן בעבר והעבירו את תרחיף התאים המנותק לבקבוק.

דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית הרקמה למשך יומיים ולאחר מכן החליפו את המדיה. לאחר מכן יש להחליף את המדיה כל 3 ימים לאחר מכן.

האסטרוציט אמור להופיע בשילוב עם שכבה עליונה של מיקרוגליה לאחר 7 עד 8 ימים בתרבית. בשלב זה, הצב את בקבוק ה-T75 על שייקר מסלולי המוגדר ל-180 סיבובים לדקה למשך 30 דקות כדי להסיר מיקרוגליה.

השליכו את הסופרנטנט המכיל מיקרוגליה או סובבו אותו וצלחת לתרבית. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיליליטר של תרבית אסטרוציטים טריים והמשיכו בניעור הבקבוק ב-240 סל"ד למשך 6 שעות כדי להסיר תאי מבשר אוליגודנדרוציטים.

מכיוון שחלק מה-OPCs לא יתנתקו לחלוטין משכבת האסטרוציטים, המשיכו לנער במרץ ביד במשך דקה אחת על מנת למנוע זיהום OPC. שוב, השליכו את הסופרנטנט או סובבו אותו על צלחת כדי לתרבית OPCs.

שטפו את שכבת האסטרוציטים המשולבת שנותרה פעמיים עם PBS. שאפו את ה-PBS והוסיפו 5 מיליליטר טריפסין-EDTA. דגירה בחממת תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בדקו אם יש ניתוק של אסטרוציטים כל 5 דקות ואכפו את ניתוק האסטרוציטים על ידי מכה בבקבוק בכף היד פעמיים עד שלוש.

לאחר שהאסטרוציטים התנתקו מהבקבוקון, הוסיפו 5 מיליליטר של מדיום תרבית אסטרוציטים. סובבו את התאים ב-180 x גרם למשך 5 דקות, שאפו את הסופרנטנט והוסיפו 40 מיליליטר של מדיום טרי לציפוי אסטרוציטים.

בקבוק T75 אחד של תאים מעורבים בקליפת המוח אמור להניב בערך 1 כפול 10 לתאים המועשרים לאסטרוציטים לאחר המעבר הראשון.