תרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה: הליך לבידוד ותרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה

כדי לבודד תאי אנדותל במוח, ראשית, העבירו מוח חולדה שנקטף לתוך צלחת המכילה בופר מקורר.

לאחר הסרת המוח הקטן ועצבי הראייה, חלקו את המוח להמיספרות מוחיות. לאחר מכן, הפרד את המוח התיכון מהמוח הקדמי.

הסר את קרומי המוח ואת החומר הלבן המכיל מיאלין מהמוח הקדמי, והשאיר מאחור את קליפת המוח לבידוד כלי המיקרו

.

לאחר מכן, הומוגניזציה של קליפת המוח כדי לשבור את רקמת העצבים והמרכיבים.

צנטריפוגה ההומוגנית להסרת פסולת תאית ומיאלין.

לאחר מכן, טפל בכדור הרקמה עם קוקטייל עיכול המכיל אנזימים קולגנאז, דיספאז ודאוקסיריבונוקלאז.

קולגנאזות ודיספאזות מעכלות את המטריצה החוץ-תאית המטמיעה את המיקרו-כלי ומשחררות את שברי המיקרו-כלי מהרקמה. דאוקסיריבונוקלאזים מפרקים כל DNA חופשי המשתחרר מתאים ליזים.

מערבבים את הנפח הרצוי של ההומוגנט המעוכל עם מדיום שיפוע וצנטריפוגה בצפיפות מתאימה.

השליכו את המיאלין ואת השכבה העליונה המכילה תאים פרנכימליים במוח, ואחריהם את הסופרנטנט.

כעת, טפל בגלולה המכילה מיקרו-כלי עם קוקטייל העיכול כדי לשחרר לחלוטין את שברי המיקרו-כלי המורכבים מתאי אנדותל ופריציטים.

צנטריפוגה את המתלים. השעו מחדש את הגלולה המכילה שבר מיקרו-כלי במדיה מתאימה בתוספת פורומיצין - אנטיביוטיקה.

זרעו את התרחיף לצלחת מצופה חלבון מטריצה חוץ-תאית ודגרו.

שברי המיקרו-כלי נצמדים לציפוי בצלחת. פורומיצין מסלק באופן סלקטיבי פריציטים, בעוד שרכיבי המדיה מקלים על התפשטות תאי האנדותל.

הוציאו את המוח מהגולגולת של שלוש חולדות וויסטאר בנות 5 שבועות והעבירו את המוחות לצלחת פטרי מלאה במאגר דיסקציה קר המוחזק על קרח.

נתח את המוח ללא המוח הקטן ועצבי הראייה. לאחר מכן, חתכו כל מוח לשניים כדי להפריד בין שתי ההמיספרות המוחיות.

תחת הסטריאומיקרוסקופ, בצע חתך נוסף כדי להסיר את המוח התיכון ולהעביר את כל המוח הקדמי לצלחת פטרי נקייה על קרח עם מאגר דיסקציה.

לאחר מכן, העבירו מוח קדמי אחד לצלחת פטרי חדשה מלאה במאגר דיסקציה קרה. החזק אותו עם המהדק ונתק בזהירות את קרומי המוח מקצוות המוח הקדמי.

לאחר מכן, הפוך את המוח הקדמי ומשוך בזהירות את קרומי המוח מבלי לקרוע אותם. ודא שהמוח הקדמי מנוקה מקרומי המוח וחתך את החלק הנותר של עצבי הראייה. מטרת שלב זה היא להסיר את שמיכת הפוך של החומר הלבן כדי לקבל מעטפת של קליפת המוח.

התחל בהידוק המוח הקדמי בקצה ואז גרור בזהירות את המלקחיים לאורך פני השטח, תוך הקפדה לא לקרוע את פני השטח של קליפת המוח.

לאחר מכן, ודא שהמוח נקי מקרומי המוח על ידי גלגולו כדי לבדוק שאין שאריות של קרומי המוח או כלי שטח גדולים.

לאחר מכן, החל מחילוץ שלושת המוחות מהגולגולת שלהם, הזמן המלא לדיסקציה לא אמור לקחת יותר משעתיים לשימור רקמות והישרדות תאים. העבירו את קליפות המוח של שלושה מוחות ל-6 מיליליטר של מאגר דיסקציה קרה בהומוגנייזר Dounce של 7 מיליליטר.

לאחר מכן, נתק את קליפת המוח עם 10 משיכות למעלה ולמטה עם העלי הראשון בעל מרווח גדול יותר, ואחריו 10 משיכות למעלה ולמטה עם העלי השני בעל מרווח קטן יותר.

לאחר מכן, העבירו 6 מיליליטר מהמתלה לצינור פלקון חדש בנפח 50 מיליליטר ושטפו את ההומוגנייזר של Dounce עם 24 מיליליטר של מאגר חיתוך קר. חלקו את התרחיף לשלושה צינורות פלקון כדי לקבל שווה ערך לקליפת מוח אחת לכל צינור.

לאחר מכן, צנטריפוגה בחום של 1000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. התבוננות בגלולה מראה שיפוע של צבע ורוד, המייצג את החלק המיקרו-כלי של ההומוגנט של קליפת המוח.

כעת, השליכו את הסופרנטנט והומוגניזציה של הגלולה מקליפת מוח אחת עם מיליליטר אחד של תמיסה אנזימטית המכילה תערובת של קולגנאזות, דיספאז, DNase סוג 1 וגנטמיצין.

מניחים את הצינורות בשייקר למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מערבבים 1 מיליליטר עיכול עם 10 מיליליטר של 25% BSA/HBSS 1X ומערבלים בעדינות את הצינורות. לאחר מכן, הפרד אותם על ידי צנטריפוגה תלוית צפיפות ב -3,600 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגה התלויה בצפיפות, הגלולה מכילה את המיקרו-כלים והדיסק העליון מכיל מיאלין, פרנכימה מוחית ומיקרו-כלי דם שיוריים.

העבירו בזהירות את הדיסק העליון ואת הסופרנטנט לתוך צינורות פלקון נקיים בנפח 50 מיליליטר; הקפידו לא לשאוב את כדור המיקרו-כלי.

מערבל בעדינות את הצינור וחזור על הצנטריפוגה התלויה בצפיפות. במהלך הצנטריפוגה השנייה הזו, שמור את הכדור שהתקבל המכיל את המיקרו-כלים ב-4 מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה השנייה התלויה בצפיפות, השליכו בזהירות את הדיסקה העליונה ואת הסופרנטנט. מערבבים ומשעים מחדש את הכדורים המתקבלים המכילים את המיקרו-כלים משתי הצנטריפוגות עם 1 מיליליטר HBSS 1X קר.

לאחר מכן, שטפו את המיקרו-כלים עם 20 מיליליטר HBSS 1X קר וצנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט, והקפידו לא לאבד את כדור המיקרו-כלי.

הומוגניזציה של גלולת המיקרו-כלי מקליפת מוח אחת עם 1 מיליליטר של אותה תמיסה אנזימטית בעקבות מערבולת עדינה של הצינורות. יתר על כן, עכל את כלי המיקרו למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס בשייקר. לאחר מכן, מערבבים את המיקרו-כלים המעוכלים משלושת קליפות המוח לצינור אחד.

שוב, הפרד את התערובת לשני צינורות פלקון של 50 מיליליטר כדי לקבל את המיקרו-כלים המופקים משווה ערך לקליפת עץ וחצי לכל צינור. לאחר מכן, צנטריפוגה בחום של 1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

רגע לפני ציפוי המיקרו-כלים, קח שתי צלוחיות T75 מצופות מהחממה ושאף את עודפי הציפוי. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור המיקרו-כלי ב-1 מיליליטר של ECM.

הביאו כל שפופרת ל-10 מיליליטר עם ECM בתוספת 4 מיקרוגרם למיליליטר פורומיצין כדי להתחיל בתהליך הטיהור וצלחת את המיקרו-כלים בבקבוק.

לאחר מכן, הכניסו את הצלוחיות לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר הידבקות של כלי מיקרו למטריצת הקולגן-פיברונקטין