בידוד תאי מוח מזחלי דגי זברה: שיטה להשגת נוירונים, מקרופאגים ותאי מיקרוגליה שלמים מרקמת המוח של דגי הזברה

מוח דג הזברה מורכב מנוירונים - תאי עצב הממלאים תפקיד בולט בעיבוד מידע. בנוסף, הוא מורכב מאוכלוסייה של תאים חיסוניים תומכים, כולל מקרופאגים ומיקרוגליה, המאכלסים את החלל הבין-עצבי.

כדי לבודד את כל סוגי תאי המוח הללו מדג זברה, ראשית, קחו זחלי דג זברה מורדמים בצלחת פטרי המכילה מדיה מתאימה.

דמיינו את דג הזברה תחת סטריאומיקרוסקופ והעבירו את ראשי הזחלים מעל שק החלמון כדי לשמור על המוח שלם.

העבירו את הראשים הכרותים להומוגנייזר מלא במדיה מקוררת מראש, המונחת על קרח. טמפרטורה נמוכה מסייעת במניעת פירוק תאי המוח.

בעזרת עלי, הומוגניזציה של רקמת המוח של דג הזברה. הומוגניזציה מפרקת את המטריצה החוץ-תאית ויוזמת דיסוציאציה של נוירונים, מקרופאגים ומיקרוגליה מרקמת המוח.

שלב זה גם מפריד בין מיאלין - שכבת בידוד עשירה בשומנים - לבין נוירונים.

העבירו את ההומוגנאט דרך מסננת כדי ללכוד גושי תאים גדולים.

צנטריפוגה את המסנן כדי לגלול את התאים ושברי מעטפת המיאלין. השליכו את הסופרנטנט המכיל פסולת.

השעו מחדש את הגלולה במדיום שיפוע צפיפות מתאים וכסו אותה עם מאגר.

סובב את הצינור במהירות נמוכה. שברי המיאלין הבהירים יותר יוצרים פס מובהק בממשק של אמצעי שיפוע המאגר והצפיפות, בעוד שהתאים הצפופים יותר מתיישבים בתחתית.

שאפו את השכבות העליונות והשעו מחדש את תאי המוח במדיה טרייה לשימוש נוסף.

הוסף 1.5 מיליליטר של טריקאין 15 מילי-מולרי לכל 50 מיליליטר של זחלים בינוניים עד 50 כדי להכין הרדמה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה של פסטר בנפח 3 מיליליטר כדי להעביר 10 זחלים בכל פעם לצלחת פטרי בגודל 55 מילימטר מלאה במדיום E3 קר כקרח עם טריקאין כדי להרדים אותם סופית.

תחת סטריאומיקרוסקופ, יישר 10 זחלים במרכז צלחת הפטרי. לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים, העבירו את ראשי הזחל מעל שק החלמון.

בעזרת פיפטה פסטר בנפח 3 מיליליטר, קחו את כל הראשים, ועם כמה שפחות נוזלים, העבירו אותם להומוגנייזר זכוכית על קרח המכיל 1 מיליליטר מדיה A קרה כקרח.

החלף כל צלחת פטרי קטנה המכילה E3 קר כקרח בתוספת טריקאין בחדשה כל 30 דקות כדי להבטיח שהחתך מתבצע במדיום E3 קר בתוספת טריקאין.

החלף את המדיה A הקרה כקרח בהומוגנייזר הזכוכית כאשר הצבע מתחיל לדעוך. לאחר איסוף כל קבוצת הראשים, הסר את כל המדיה A מההומוגנייזר של הזכוכית והחלף אותה ב-1 מיליליטר של מדיה A קרה כקרח.

כשההומוגנייזר עדיין על הקרח, השתמשו בעלי צמוד כדי לשבש את רקמת המוח על ידי ביצוע 40 סיבובי ריסוק וסיבובים לזחלים של 3 עד 5 dpf ו-50 סיבובים לזחלים של 7 ו-8 dpf.

לאחר מכן, הוסף 2 מיליליטר של מדיה A לתרחיף התאים כדי לדלל את התאים ולהפחית את הצטברות שלהם עם מיאלין. לחסל את הצטברות התאים על ידי העברת תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך צינור בז קר של 50 מיליליטר על קרח. חזור על שלב זה שלוש פעמים.

העבירו 1 מיליליטר של תרחיף תאים לצינורות קרים של 1.5 מילימטר, וסובבו אותם בטמפרטורה של 300 x גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות מזרק של 10 מיליליטר עם מחט 23G x 1 אינץ', הסר את הסופרנטנט.

עם 1 מיליליטר של מדיום שיפוע בצפיפות 22% קר כקרח, מכוסה בעדינות ב-0.5 מיליליטר של 1x DPBS קר כקרח, השהה בעדינות את כדור התא. סובב את הצינורות ב-950 x גרם ללא הפסקה ותאוצה איטית ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר הסיבוב, השליכו את מדיום שיפוע הצפיפות DPBS והמיאלין הכלואים בממשק. לאחר מכן, השתמשו ב-0.5 מילימטרים של מדיה A עם 2% NGS כדי לשטוף את התאים ולסובב את הצינורות ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

הסר כמה שיותר סופרנטנט, ואז משוך את כדוריות התא מאותו מצב ניסוי יחד במיליליטר אחד של מדיה A עם 2% NGS.

אם התאים המעניינים מבטאים חלבון פלואורסצנטי, העבירו את תרחיף התא דרך מכסה מסננת תאים של 35 מיקרון והעבירו אותם לצינורות FACS קרים של 5 מיליליטר על קרח מוגן מאור.