יצירת תאי גזע עצביים מושרים (iNSCs) מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMNCs): הליך מבוסס וירוס סנדאי לתכנות מחדש של PBMNCs לתאי גזע מושרים

כדי לתכנת מחדש תאים סומטיים לתאי גזע עצביים מושרים או iNSCs - תאי גזע בעלי יכולת חידוש עצמי והתמיינות גבוהה, התחל בתרבית תאים חד-גרעיניים בדם היקפי במדיום נטול סרום כדי להרחיב אריתרובלסטים.

לאחר מכן, פיפטה את מתלה האריתרובלסטים לצלחת תרבות. טפל בתאים עם נגיף סנדאי רקומביננטי או SeV. וירוסים אלה מקודדים תכנות מחדש של גורמי שעתוק. צנטריפוגה כדי לשקוע את התאים ולדגור.

לאחר היתוך SeV לקרום התא המארח, גנום הנגיף עובר שעתוק ואחריו תרגום בציטופלזמה. הביטוי החוץ רחמי של גורמי שעתוק מפעיל את תהליך התכנות מחדש של התא מבלי לשלב את הגנים בגנום המארח.

כעת, צנטריפוגה את התרבית כדי להסיר את הנגיפים. השעו מחדש את התאים המומרים במדיה מתאימה, ואחריה ציפוי. יתר על כן, צנטריפוגה להסרת פסולת תאית. השעו מחדש את התאים במדיית iNSC.

לאחר מכן, זרעו את התאים בצלחת מצופה חלבון. התאים מתחברים לציפוי החלבון בצלחת. השלם את התאים הדבוקים במדיה iNSC בימים לסירוגין. לאחר שבוע של תרבות, החלף את המדיה המבוזבזת במדיה חדשה של iNSC מדי יום.

גורמי הגדילה והמרכיבים הכימיים במדיה שומרים על התחדשות עצמית ותומכים בפלוריפוטנטיות של תת-קבוצה של תאים מותמרים, ומתכנתים אותם מחדש לחלוטין ל-iNSCs. עם הזמן, התאים מתחילים ליצור מושבות iNSC. בחר את המושבות הרצויות לתרבית.

ביום 0, אספו את התאים במדיום MNC והעבירו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של התאים ב-200 x גרם למשך 5 דקות, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים עם 1 מיליליטר של מדיום MNC שחומם מראש. ספרו את התאים הקיימים עם Trypan Blue ולאחר מכן השעו אותם מחדש עם מדיום MNC שחומם מראש לריכוז של 200,000 תאים לבאר בצלחות של 24 בארות.

הפשירו את הצינורות שהוצאו מאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס המכילים את נגיף סנדאי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 10 שניות ולאחר מכן השאירו אותם להפשרה בטמפרטורת החדר. לאחר ההפשרה, הניחו אותם מיד על קרח. הוסף את נגיף הסנדאי המופשר לבארות של צלחת 24 הבארות עם MNCs בריבוי הדבקה של 10. כדי להקל על הצמדת התאים, צנטריפוגה את הצלחות ב -1,000 x גרם למשך 30 דקות, ולאחר מכן הניחו את הצלחות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני.

ביום הראשון, העבירו את התאים עם המדיום לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. כדי לנתק עוד יותר את התאים הנותרים, יש לשטוף את הבארות עם 1 מיליליטר של מדיום MNC לבאר ולהוסיף את התאים עם המדיום לצינור. לאחר צנטריפוגה של תרחיף תאים זה ב-200 x גרם למשך 5 דקות, שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים עם 500 מיקרוליטר של מדיום MNC טרי שחומם מראש והוסיפו לבאר של צלחת של 24 בארות.

ביום השני, השתמש ב-1 מיליליטר לבאר של 50 מיקרוגרם מדוללים בעבר למיקרוליטר פולי-D-ליזין ו-D-PBS כדי לצפות צלחות של 6 בארות למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר. שואבים פולי-D-ליזין מלוחות 6 הבארות ומייבשים על הספסל הנקי האנכי למשך כ-10 דקות. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר לבאר של 5 מיקרוגרם למיליליטר למינין מדולל בעבר לצלחות 6 הבארות ודגר במשך 4 עד 6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לציפוי. שטפו את הצלחות עם D-PBS לפני השימוש.

ביום השלישי, צלחת כל נגיף סנדאי התמיר MNCs במדיום תאי גזע עצביים מושרה על לוחות 6 בארות מצופים פולי-D-ליזין. בימים 5 ו-7, הוסף בעדינות 1 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מדיום iNSC מחומם מראש לכל באר של צלחות 6 הבארות.

מהיום ה-9 עד היום ה-28, יש להחליף את המדיום במדיום iNSC טרי שחומם מראש מדי יום. עקוב אחר הופעתן של מושבות iNSC, ותוך כשבועיים עד שלושה, בחר מושבות עם מורפולוגיה מתאימה באמצעות פיפטות זכוכית שרופות. לאחר מכן, העבירו כל מושבה לבאר נפרדת של צלחת בת 6 בארות להרחבה.