הכנת פיגום זרעי MSC: טכניקה להכנת פיגומים עם תאי גזע מזנכימליים להשתלה כירורגית במודל מורין

תאי סרטן מייצרים גורמי ביות כימוטקטיים כדי למשוך את תאי הגזע המזנכימליים או MSCs מכלי הדם לעבר מיקום הגידול.

כדי לחקור את ההשפעה של תאים אלה על צמיחת הגידול במבחנה, התחל בנטילת מצע פיגום מעוקר. העבירו אותו לצלחת באר המכילה את המדיה הרצויה כדי להרטיב מראש את הפיגום. הנח אותו על משטח יבש כדי להסיר עודפי מדיה שנדבקים לפיגום להדבקה טובה יותר של התאים. מעבירים את הפיגום המיובש חלקית לבאר טרייה. זרע טיפה של תרחיף MSC על הפיגום.

בנוסף, הוסף מדיה נוספת בפינות הבאר כדי ליצור תא הידרציה המונע אידוי מדיה מהטיפה במהלך הדגירה שלאחר מכן. דגירה כדי לאפשר ל-MSCs להיצמד למשטח הפיגום. הפוך את הפיגום כדי לחשוף את המשטח הלא זרוע. פיפטה טיפה טרייה של מתלי MSC בצד זה ותן ל-MSC להיצמד.

לאחר ש-MSCs נדבקו לשני צידי הפיגום, כסו אותו במדיה נוספת וודא שכל התאים נמצאים במגע עם המדיה. דגירה עד שה-MSCs גדלים ומסתננים לתוך המרווחים והנקבוביות של הפיגום. פיגום הזרעים של MSC מוכן להשתלה כירורגית.

הכן את הפיגומים 48 שעות לפני ההשתלה בעכברים על ידי חיתוך פיגומי PLA לחתיכות בגודל חלל כריתה של כ-2 על 2 מילימטרים. עקרו את הפיגומים על ידי טבילה באתנול 70% למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, טבלו את הפיגומים ב- PBS. לאחר מכן, הניחו את הפיגומים במדיום הנשר המותאם של Dulbecco המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין תוך הכנת תאים לזריעה.

כדי להכין את התאים, ראשית, הרם MSCs מתורבתים באמצעות 0.05% טריפסין. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר הדגירה, ודא שהתאים התרוממו. לאחר מכן, הוסף DMEM לבקבוק כדי להשבית את הטריפסין. לאחר מכן, העבירו את תכולת הבקבוק לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, גלולה 5 פעמים 10 עד ה-MSCs החמישי עבור כל פיגום באמצעות צנטריפוגה ב-100 x גרם למשך 5 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את ה-MSCs ב-5 מיקרוליטרים של DMEM לכל 5 פעמים 10 לתאים החמישיים. לאחר מכן, הסר פיגום מטבילת DMEM בעזרת מלקחיים והניח אותו על מכסה צלחת 6 הבארות. הרם את הפיגום מהמכסה, והשאיר אחריו טיפה של עודף DMEM. הנח את הפיגום בחזרה על המכסה במקום יבש חדש. חזור על הפעולה שלוש עד חמש פעמים. לאחר מכן, הניחו את הפיגום המיובש חלקית בצלחת חדשה בת 6 בארות לזריעה.

פיגום מיובש חלקית מספק תוצאות אופטימליות של זריעת תאים. אם הפיגום רטוב מדי, התאים יחליקו מהפיגום וייצמדו לצלחת שמתחת. אם הפיגום אמור להתייבש, הטיפה לא תתפשט על פני כל הפיגום, וכתוצאה מכך פיזור תאים ראשוני לקוי.

בעזרת פיפטה, ערבבו בעדינות את הצינור של MSCs כדי להומוגניזציה של התרחיף מכיוון שייתכן שחלק מהתאים שקעו בתחתית. פיפטה לאט 2.5 מיקרוליטר של תרחיף MSC טרי מעורבב ישירות על הפיגום, ויוצר טיפה קטנה מעל החלק העליון של הפיגום. הוסף 300 מיקרוליטר של DMEM לקצוות כל באר כדי למנוע אידוי מהיר של טיפת התא. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מה שמאפשר לתאים להיצמד לפיגום.

לאחר הדגירה, השתמש במלקחיים כדי להפוך בעדינות את הפיגומים בצלחת הבאר. זרע 2.5 מיקרוליטר של תרחיף MSC מעורבב טרי כדי לתת בסך הכל 5 כפול 10 לתאים החמישיים שנזרעו לכל פיגום. לאחר דגירה של 30 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לפיגום, כסו את הפיגומים ב-DMEM על ידי הוספת 2 מיליליטר לכל באר בצלחת 6 הבארות. הרם בעדינות את הפיגומים כדי לאפשר למדיה לזרום מתחתיהם. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במצב זה במשך 48 שעות לפני ניתוח ההשתלה.