בידוד נימי מוח ממוח האדם: שיטה אופטימלית לחילוץ נימי מוח מרקמת מוח אנושית

נימי המוח הם מרכיב חיוני במחסום הדם-מוח - מחסום חדיר למחצה המאפשר תנועה סלקטיבית של מומסים בין הדם למוח. כדי לבודד נימים מוחיים, התחל עם רקמת מוח אנושית טרייה. הסר את קרומי המוח וקוצץ את החומר הלבן.

טחנו את רקמת המוח לרסיסים קטנים יותר. מעבירים את השברים להומוגניזטור המכיל חיץ והומוגניזציה מתאימים. הומוגניזציה מפרקת את הרקמות, ומשחררת נימים ופסולת רקמות לתמיסה.

העבירו את ההומוגנאט לצינור טרי והוסיפו נפח אופטימלי של מדיום שיפוע צפיפות מתאים. צנטריפוגה התמיסה לכדור הנימים. מדיום שיפוע צפיפות רב מדי או מעט מדי מביא לתשואה נימית נמוכה. הסר את ה-supernatant.

השעו מחדש את הגלולה באלבומין בסרום בקר או במאגר בתוספת BSA. BSA מייצב אנזימי עיכול ושומר על השלמות המבנית של נימים. לאחר מכן, סנן את התמיסה עם פילטר מתאים להסרת כלים גדולים ופסולת רקמות.

לאחר מכן, העבירו את המסנן דרך מסנן רשת קטן יותר. מסנן זה שומר על נימי המוח ומאפשר לפסולת קטנה יותר ולתאי דם אדומים לעבור דרכם. לאחר מכן, הפוך את המסנן ושטוף את הנימים בצינור טרי עם מאגר בתוספת BSA.

צנטריפוגה את התמיסה והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את הנימים הטהורים במאגר ואחסנו אותם לשימוש נוסף.

כדי להתחיל בהליך זה, תעד את משקל רקמת המוח האנושית, שאמור להיות כ -10 גרם. מתחת למיקרוסקופ, הסר בזהירות את כל קרומי המוח בעזרת מלקחיים, והשתמש באזמל כדי לחתוך את החומר הלבן. לאחר מכן, חותכים בזהירות את רקמת המוח וטוחנים אותה בעזרת אזמל למשך כ -5 דקות.

העבירו את רקמת המוח למטחנת הרקמות והוסיפו 30 מיליליטר של מאגר בידוד. לאחר מכן, הומוגניזציה של כל דגימה ב-100 פעימות ב-50 סל"ד. אין לערבב באוויר כדי למנוע בועות. תעד את הזמן כל 25 פעימות ואת הזמן הכולל הדרוש ל-100 פעימות. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט להומוגניזטור Dounce על קרח. הומוגניזציה של המתלה למשך כ -20 פעימות והימנע מבועות.

לאחר מכן, חלקו את המוח באופן שווה לארבעה צינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר ותעדו את הנפח הכולל של ההומוגנאט. הקפד להוסיף את עוצמת הקול הנכונה של Ficoll. מעט מדי או יותר מדי פיקול יגרום לצפיפות שגויה להפרדת נימים מפסולת תאית ובכך יפחית את הגלולה הנימים ויגביל את התשואה.

השתמש ב-10 מיליליטר של מאגר בידוד כדי לשטוף את העלי וההומוגנייזר ולהפיץ אותו לארבעת צינורות הצנטריפוגה. לאחר מכן, הפיצו 50 מיליליטר של מאגר שיפוע צפיפות לצינורות הצנטריפוגה. סגור היטב את צינורות הצנטריפוגה עם כובעים. לאחר מכן, מערבבים את ההומוגנט, מדיום שיפוע הצפיפות והמאגר על ידי ניעור נמרץ של הצינורות. צנטריפוגה ב-5,800 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש כל כדור ב-2 מיליליטר של 1% BSA.

לאחר השעיית הגלולה, סנן את המתלה דרך רשת 300 מיקרומטר. נימים מסוננים דרך הרשת, בעוד שכלי דם גדולים יותר ופסולת מוח גדולה יותר נשארים על הרשת. שטפו בזהירות את הרשת עם עד 50 מיליליטר של 1% BSA, ואז השליכו את הרשת. כדי להפריד את הנימים מתאי דם אדומים ופסולת מוחית אחרת, פזרו את תסנין הנימים על פני מסנני מתח תאים של 530 מיקרומטר.

נימים מעוכבים על ידי מסנן זה, בעוד שתאי דם אדומים, תאים בודדים אחרים ופסולת מוחית קטנה עוברים דרך המסנן ונאספים במסנן. לאחר מכן, שטפו כל פילטר עם 25 מיליליטר של 1% BSA. יוצקים את כל המסננים על המסנן השישי כדי להגדיל את התשואה. שוטפים כל פילטר עם 50 מיליליטר של 1% BSA. שמור על מסנני מתח התאים המכילים את הנימים והשליך את המסנן. לאחר מכן, הפוך את המסננים ושטוף את הנימים עם 50 מיליליטר של 1% BSA לצינורות של 50 מיליליטר.

הפעל בעדינות לחץ עם קצה הפיפטה והעבר אותו על פני המסנן כדי לשטוף את נימי המוח. הקפידו לשטוף את כל נימי המוח, במיוחד משפת המסנן. הימנע מבועות מכיוון שהדבר מקשה על תהליך הסינון ומגדיל את הסיכוי לאובדן נימים. לאחר איסוף הנימים, צנטריפוגה את כל הדגימות ב-1,500 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בכ-3 מיליליטר של מאגר בידוד.

לאחר מכן, שלב את כל הכדורים המרחפים מדגימה אחת בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומלא אותו במאגר בידוד. שוב צנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ושטיפה פעמיים נוספות. תעד את טוהר הנימים באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה של פי 100 ומצלמה. כעת ניתן להשתמש בנימי המוח המבודדים לניסויים, לעבד אותם או להקפיא אותם, ולאחסן אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס בצינורות קריו-טיוב למשך 6 עד 12 חודשים לפחות.