Zymography פפטיד פלואורסצנטי: טכניקה שונה לזיהוי פעילות פרוטאז באמצעות מצעים פלואורוגניים בג'ל זימוגרפיה
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:05 דק׳ • July 8th, 2025
זימוגרפיה היא טכניקה אלקטרופורטית הכוללת מצע חלבון שעובר קופולימר עם ג'ל פוליאקרילאמיד כדי לזהות אנזימים הידרוליטיים ופעילותם. כדי להתחיל, ממיסים דגימות במאגר זימוגרפי המכיל גליצרול, נתרן דודציל סולפט או SDS, וברומופנול כחול.
גליצרול הופך את מאגר הדגימה לצפוף יותר מהמאגר הרץ של הג'ל שמסביב, ומאפשר טעינה קלה לכיסי הג'ל. SDS - חומר ניקוי אניוני - מנטרל אנזימים בדגימה ומצפה אותם במטען שלילי. ברומופנול כחול - צבע מעקב - מסייע לעקוב אחר התקדמות הדגימה בג'ל.
טען את הדגימות בג'ל פוליאקרילאמיד משובץ במצעים פלואורוגניים כדי לזהות פעילות פרוטאז. כעת, חבר את האלקטרודות והתחל באלקטרופורזה. השדה החשמלי שנוצר גורם לכל האנזימים הקשורים ל-SDS לנדוד דרך הג'ל לעבר האלקטרודה הטעונה חיובית.
לאחר השלמת האלקטרופורזה, הסר את הג'ל ושטוף אותו במאגר רנטורינג המכיל חומר ניקוי לא יוני שמחליף SDS כדי לאפשר רנטורציה של אנזימים. לאחר מכן, דגרו את הג'ל במאגר מתפתח המכיל קטיונים דו-ערכיים המפעילים את האנזימים בג'ל.
הפרוטאזות הפעילות מבקעות את המצעים הפלואורוגניים, וגורמות לעלייה בקרינה. דמיין את הג'ל כדי להתבונן ברצועות חלבון פלואורסצנטיות שעוצמתן פרופורציונלית לפעילות הפרוטאז.
כדי להתחיל, ממיסים דגימות במאגר דגימת זימוגרפיה קונבנציונאלי. הוסף 400 מיליליטר של מאגר ריצה 1x Tris-Glycine SDS למנגנון הג'ל. טען עד 35 מ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים