JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 5:19 דק' • July 8th, 2025
התחל בלקיחת מודל עכבר נקבה מורדם בהריון המונח במצב שכיבה. הכינו את העכבר על ידי הסרת שיער מאזור הבטן. חתכו את העור ואת שכבות השרירים שמתחתיו כדי לחשוף את קרני הרחם - האתרים המארחים עוברים ברי קיימא.
כעת, משוך את קרני הרחם מחלל הבטן. קח נימי זכוכית חדים המכילה את תמיסת ה- DNA הרצויה של הפלסמיד. אתר את מוח העובר והזריק את תמיסת ה- DNA של הפלסמיד דרך דופן הרחם לחדר הרביעי. מיקום זה קדמי לפרימורדיום המוח הקטן - המיקום הרצוי להעברת DNA בסופו של דבר.
לאחר ההזרקה, משוך את הנימים הריקים. לאחר מכן, לצורך אלקטרופורציה של העובר המוזרק DNA, מקם את שתי האלקטרודות מעל דופן הרחם כך שהאלקטרודה החיובית תכסה את פרימורדיום המוח הקטן והאלקטרודה השלילית תכסה את האזור סביב האוזניים.
החל פולסים חשמליים למשך הזמן הרצוי. פולסים אלה הופכים את תאי העצב המוחיים לחדירים, ומאפשרים ל- DNA הפלסמיד להיכנס לתאים הממוקדים. לבסוף, הנח את קרני הרחם בחזרה בתוך חלל הבטן במיקומן הטבעי. תפרו את החתכים, העבירו את העכבר לכלוב שלו ואפשרו לו להתאושש.
התחל בהעמסת נימי זכוכית בורוסיליקט לתוך מושך מיקרופיפטה ומשיכה ליצירת קצה עדין. סמן את קצה הנימים בדיו שחור להדמיה טובה יותר במהלך ההזרקה וצייר קנה מידה על הזכוכית. בעבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש בסרגל ובפינצטה מחט חדה כדי לקצץ את הקצה לאורך של כ -6 מילימטרים וליצור קצה משופע חד צדדי.
סנן תמיסת מלאי מהיר של 1% ירוק דרך מסנן של 0.22 מיקרון כדי להסיר חלקיקי צבע מהתמיסה. מערבבים את פלסמידי ה-RNA היחידים בחלקים שווים עם הפלסמיד המדווח על לוציפראז לריכוז סופי של לפחות 1 מיקרוגרם למיליליטר עבור כל פלסמיד.
צבעו את תמיסת הפלזמה בירוק מהיר בריכוז סופי של 0.05%. לאחר הרדמת עכבר CD-1 בהריון עם איזופלורן, הניחו את העכבר על גבו על כרית חימום והניחו משכך כאבים. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בעיניים במהלך הניתוח. תקן את הגפיים בעזרת סרט ועיקר את הבטן בעזרת חומר חיטוי.
מכסים את העכבר בגזה ומשאירים רק את אזור הניתוח חשוף. לאחר ביצוע חתך בעור באורך של כ -2 סנטימטרים, אתר את הלינאה אלבה והשתמש במספריים רקמות עם קצה קהה כדי לבצע חתך שני מעט קטן יותר דרך הצפק. הרטיבו את חלל הבטן הפתוח עם PBS סטרילי שחומם מראש.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים טבעתיים כדי לחלץ בזהירות את קרני הרחם מחלל הבטן. אחוז בדופן הרחם ברווח שבין שקי החלמון של שני עוברים שכנים ומשוך בעדינות. הימנע מכל לחץ על העובר בזמן משיכתו דרך החתך. לאחר חילוץ קרני הרחם, יש לשאוב כ-10 עד 15 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד צבעונית עם נימי הזכוכית המוכנים. הימנע מבועות אוויר במהלך תהליך זה.
החזיקו בעדינות את העובר בעזרת מלקחיים טבעתיים ואתרו את אזור הצוואר. חודרים לאט למוח האחורי הגבי עם קצה נימי הזכוכית ועוברים לחדר הרביעי. הזרקו כ -1 מיקרוליטר מתערובת הפלסמיד. ודא שה-DNA הצבוע לא דלף מהמוח ונראה כמבנה בצורת יהלום.
כאן, חשוב ביותר למלא את כל אזור החדר הרביעי בתמיסת פלסמיד כדי להעביר DNA גם לחלק הדיסטלי של פרימוריום המוח הקטן. יחד עם זאת, הקפד לא לגרום לדימום במהלך התהליך הזה.
הנח פינצטה פלטינה המצוידת בלוחות אלקטרודות בקוטר 5 מילימטר לרוחב מעל ראש העובר כאשר הקוטב השלילי מכסה את האוזן והקוטב החיובי ממוקם בפרימורדיום המוח הקטן מעל דופן הרחם והפעל פולסים מרובעים חשמליים.
לאחר שכל העוברים עברו אלקטרופורציה, הנח בזהירות את קרני הרחם בחזרה לחלל הבטן ומלא ב-PBS סטרילי. תן לקרן הרחם להחליק למצב טבעי. כבה את ההרדמה והנח את בטן החיה כלפי מטה בכלוב חדש כדי להתאושש.