השראת גליובלסטומה באמצעות טרנספוזיציה בתיווך SB: טכניקה ליצירת מודל עכבר חדשני באמצעות שילוב מתווך טרנספוזון של פלסמיד SB במוח עכבר יילודים

התחל בלקיחת צינור המכיל תערובת של פלסמידים. היפהפייה הנרדמת או פלסמיד טרנספוזון SB מהונדס לשאת אלמנט הניתן להעברה המורכב מאונקוגן הגורם לגליובלסטומה שמקורו באדם הדחוק בין שני רצפים חוזרים הפוכים. בנוסף, תערובת זו מכילה פלסמיד SB transposase בעל אלמנט המבטא אנזים טרנספוזאז.

כעת, הוסף מגיב טרנספקציה מתאים לצינור. שאפו את תערובת ההזרקה למזרק המצויד במיקרו-מחט. לאחר מכן, אבטח גור עכבר מורדם במצב שכיבה על מסגרת סטריאוטקסית. דמיין את אזור הראש של הגור כדי לאתר את תפרי הגולגולת. מקם את המיקרו-מחט מעל תפרי הגולגולת.

הזרקו את התערובת לחדר הצדדי - חלל בתוך פרנכימת המוח. לאחר מכן, התמיסה מתפזרת לפרנכימה של המוח, שם מולקולות ריאגנט הטרנספקציה מקלות על כניסת פלסמידים לתאים. ברגע שנכנס לתא, הפלסמיד הטרנספוזאז מבטא את מולקולות האנזים טרנספוזאז, המזהות את רצפי החזרה ההפוכים ומוציאות את אלמנט הטרנספוזון.

לאחר מכן, היסוד הניתן להעברה DNA משלב את עצמו מחדש באזור החזרה TA של ה-DNA הגנומי של הגור. טרנספוזיציה גנטית מביאה לטרנספורמציה אונקוגנית של תאי מוח, מה שמוביל להתפתחות גליובלסטומה במוח העכבר.

3 עד 4 שבועות לפני הניסוי, הקימו כלוב רבייה של עכברים עם זכר אחד ונקבה אחת. שלבו איגלו פלסטיק צבעוני להעשרת הסביבה ולהגדלת סיכויי ההזדווגות. הסר את הזכר לאחר אישור ההריון, ו-18 יום לאחר יום ההזדווגות, התחל לעקוב אחר הנקבה ללידה. ודא שאם פונדקאית זמינה בסביבות מועד הלידה.

ביום הראשון לאחר הלידה, בצע את הזריקות התוך חדריות. הכן את תמיסת ההזרקה על ידי ציטוט ראשון של 20 מיקרוליטר מתערובת ה-DNA המכילה את הפלסמידים של הטרנספוזון בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם DNA למיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף תמיסת PEI של 20 מיקרוליטר לתמיסת ה- DNA ותן להם לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד שעה ולאחר מכן יש לאחסן את התערובת על קרח.

עבור מחט ההזרקה, חבר מזרק של 10 מיקרוליטר למחט היפודרמית בגודל 30 משופעת ב-12.5 מעלות. לאחר מכן, חבר את המזרק למשאבה עם הזרקה אוטומטית. בדוק את ההתקנה עם 10 מיקרוליטר מים והקפד לרוקן את המזרק. כעת, קררו את השלב הסטריאוטקסי של היילודים עם תערובת של קרח יבש ואלכוהול. כאשר הוא מקורר בין 2 ל -8 מעלות צלזיוס, המשך בזריקות.

הרדמו גור על ידי הנחתו על קרח למשך 2 דקות. בזמן שהגור על קרח, טען את המזרק בתמיסת ההזרקה. לאחר ההרדמה, העבירו את הגור למסגרת ושותקו את ראשו בין מוטות האוזניים המכוסים בגזה. בדוק שהצד הגבי של הגולגולת אופקי ומקביל למשטח המסגרת. כמו כן, תפרי הגולגולת צריכים להיות גלויים בבירור.

אם ראשו של הגור אינו משותק מספיק חזק, הוא יזוז במהלך ההזרקה, בעוד שאם הוא נלחץ חזק מדי בין מוטות האוזניים של המסגרת, הלמבדה לא תהיה גלויה והלחץ בתוך הראש יאלץ את התמיסה המוזרקת לדלוף החוצה.

כשהגור אוחז בחוזקה במסגרת, נגב את הראש עם 70% אתנול. לאחר מכן, הורד את המחט והתאם את מיקומה כך שהיא תיצור קשר עם הלמבדה. לאחר מכן, הרם את המחט והזיז אותה 0.8 מילימטרים לרוחב ו -1.5 מילימטרים לרוחב. לאחר מכן, הורד אותו שוב עד שהוא גומה מעט את העור. רשום את הקואורדינטות של עמדה זו. לאחר מכן, הורידו את המחט 1.5 מילימטרים דרך העור והגולגולת ולתוך קליפת המוח בחדר הצדדי.

שם, הזרקו 0.75 מיקרוליטר במשך 90 שניות והמתינו דקה כדי לתת לתמיסה להתפזר. בזמן ההמתנה, ניתן להרדים את הגור הבא שיוזרק. לאחר ההמתנה, הרם לאט את המחט. לאחר מכן, העבירו את הגור למקום התאוששות מתחת למנורת חימום. הזמן מהרדמה להתחממות חייב להיות פחות מ -10 דקות; כמה שיותר מהר יותר טוב.

עקוב אחר נשימתו, ובמידת הצורך שפשף בעדינות את הגפיים כדי לעורר את הנשימה. לאחר שהגור מתחמם, יש לו צבע ורוד ונשימה יציבה, החזירו אותו לאמו.