בדיקת פגוציטוזה חוץ גופית: שיטה מבוססת הדמיה חיה לחקר פנפטוזיס סינפטוזום בתיווך אסטרוציטים בזמן אמת

סינפטוזומים הם שברים עצביים מבודדים העשירים בשלפוחיות סינפטיות. סינפטוזומים אלה נבלעים על ידי אסטרוציטים - אוכלוסייה של תאים חיסוניים במוח - בתהליך המכונה פגוציטוזיס.

כדי לחקור פגוציטוזיס בתיווך אסטרוציטים במבחנה, התחילו בלקיחת לוחית תרבית המכילה שכבה אחת של אסטרוציטים. כעת, הוסף לצלחת מתלה סינפטוזום מצומד מחוון pH. לצבע אינדיקטור זה יש את המאפיין להאיר אך ורק ב-pH נמוך. דגרו את הצלחת למשך הזמן הרצוי.

במהלך הדגירה, פוספטידילסרין או PS הנמצאים על הממברנה החיצונית של הסינפטוזום מאפשרים לו להיקשר לקולטני ה-PS המתאימים על קרום האסטרוציטים. זה מקל על התיישבות הסינפטוזומים בבסיס. שאפו את המדיה המושקעת יחד עם סינפטוזומים לא קשורים מהצלחת.

לאחר מכן, השלם את הצלחת עם גורמים מקדמי פגוציטוזיס ודגירה. לאחר מכן, צלם את הצלחת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאשר הם נקשרים לפני השטח, אסטרוציטים בולעים את הסינפטוזומים וגורמים להם להיכנס לפאגוזומים. ברגע שנכנסים לפאגוזומים, ה-pH הנמוך גורם למולקולות הצבע של האינדיקטור להאיר בבהירות.

הדמיה בזמן אמת חושפת את נוכחותם של כתמים פלואורסצנטיים בהירים המתאימים לסינפטוזומים מצומדים של אינדיקטור ה-pH הנבלעים על ידי האסטרוציטים. בסופו של דבר, כתמים אלה נעלמים, מה שמעיד על פירוק מוצלח של סינפטוזומים.

להדמיה חיה של בליעת הסינפטוזום, ראשית, הסר את הסופרנטנט מכל באר של תרבית אסטרוציטים משולבת ושטוף במהירות את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום בסיסי אסטרוציטים חיסוני ו -5 מיקרוליטר של סינפטוזומים מצומדים של מחוון ה- pH, כמו גם כל גורם נוסף שיכול לווסת פגוציטוזיס של תאי גליה.

אפשרו לסינפטוזומים להתיישב בתחתית הבארות ולהיצמד לקולטני פוספטידילסרין על האסטרוציטים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר 40 דקות, השליכו את הסופרנטנטים ושטפו במהירות אך בעדינות את הבארות שלוש פעמים עם 1 מיליליטר DPBS לכל שטיפה.

לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום טרי בתוספת הגורמים המעניינים לבארות המתאימות והעביר את הצלחת למכשיר הדמיה חי. בחר את מיקומי ההדמיה, התאם את המיקוד, זמן החשיפה, הבהירות והספק ה-LED, והגדר את פורמט התמונה, מרווח הזמן ומספר המחזורים הכולל להדמיה חיה כמתאים מבחינה ניסיונית. לאחר מכן, התחל בהדמיה חיה של ניסויי הפגוציטוזיס.