Ex vivo electroporation of Chick Embryo Cerebellar Slices: שיטה להחדרת DNA פלסמיד המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לדמיין התפתחות תאים גרגיריים

תאי גרגיר המוח הקטן הם סוג הנוירונים הנפוץ ביותר במוח. השכבה הגרגירית החיצונית, EGL, מורכבת אך ורק ממבשרי תאים גרגיריים, GCPs, המתמיינים ונודדים פנימה ליצירת השכבה הגרגירית הפנימית, IGL.

כדי לדמיין את התפתחות התאים הגרגירים, הכינו תא אלקטרופורציה על ידי הצמדת אנודה לבסיס צלחת פטרי. הוסף מדיום תרבית לכיסוי האלקטרודה. כעת, הנח תוספת תרבית על האלקטרודה המכוסה בינונית. העבירו את פרוסות המוח הקטן של עובר הגוזל לתוספת התרבות בכיוון סגיטלי.

המישור הסגיטלי מאפשר לזהות את שכבת המטרה-EGL כנגד שכבות שונות של המוח הקטן. הוסף תמיסת צבע צמיגה המכילה DNA פלסמיד GFP מעל EGL. ה-DNA של הפלסמיד GFP מקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק המתפזר בצורה הומוגנית בתוך ציטופלזמת התא ומאפשר הדמיה של תאים חיים.

לאחר מכן, הנח קתודה בתווך ליד EGL אך לא ישירות על הרקמה. לאחר מכן, החל פולסים חשמליים מרובים על אזורי EGL שונים. הפולסים החשמליים גורמים לנקבוביות זמניות בקרום התא, ומאפשרים לתאים לקחת את ה-DNA של הפלסמיד. לאחר מכן, DNA פלסמיד מאפשר ביטוי GFP בתאים גרגירים.

דמיין את פרוסות המוח הקטן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בהתמיינות תאים גרגירים ודפוס נדידה על פני שלבים שונים של התפתחות התא.

בנה תא אלקטרופורציה על ידי קיבוע האנודה של אלקטרופורטור לבסיס צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר באמצעות סרט בידוד. הוסף כ -1 מיליליטר HBSS כדי לכסות את האלקטרודה. לאחר מכן, הניחו תוספת תרבית של 0.4 מיקרומטר על גבי האלקטרודה המכוסה ב-HBSS.

השתמש בפיפטה פסטר בנפח 3 מיליליטר עם קצה חתוך כדי להעביר את הפרוסות שזוהו, עד 5 לכל תוספת לתוספת התרבית. לאחר מכן, הפרד את הפרוסות ואפשר להן להתיישב על תוספת התרבות בכיוון סגיטלי. בעזרת פיפטה מוציאים עודפי מדיום מפרוסות המוח. הניחו לתוספת לנוח על האלקטרודה כך שיהיה מגע בין התוספת לאלקטרודה.

במערך זה, תוספת התרבית עם הפרוסות תנוח על פני המדיום, תשמור על המעגל אך תאפשר מיקוד מרחבי של הקתודה. באמצעות קצה פיפטה P10, פיפטה 5 מיקרוליטר של DNA מדולל ב-20% ירוק מהיר על פני השטח של אזור ממוקד של כל פרוסה. התוספת של Fast Green מבטיחה שתמיסת ה-DNA צמיגה מספיק כדי למנוע פיזור רחב של ה-DNA.

לאחר מכן, הנח את הקתודה על הרקמה הממוקדת הרצויה ואלקטרופור את הדגימות. הימנע ממגע ישיר של הקתודה עם הרקמה על ידי הצבת הקתודה קרוב ככל האפשר לרקמה מבלי לגעת בה בפועל. חזור על האלקטרופורציה במספר אזורים של השכבה הגרגירית החיצונית על כל פרוסת מוח קטן בודדת כרצונך.

בסיום, העבירו את תוספת התרבות לצלחת פטרי בגודל 30 מילימטר. לכל תרבית, הוסף 1 מיליליטר של מדיום תרבית מחומם מראש מתחת לתוספת התרבות. וודא שהתוספת לא צפה על המדיום. תוספת התרבות צריכה להיות במגע עם המדיום, אך אין לרחוץ בו את הפרוסות.