אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות: טכניקה במבחנה להעברת פלסמידים בתוך נוירונים ממוקדים בפרוסות היפוקמפוס במוח

התחל באלקטרופורציה על ידי נטילת פיפטת זכוכית המכילה את תמיסת הפלסמיד הרצויה. חבר אותו למחזיק מיקרופיפטה המצויד באלקטרודת חוט כסף, וודא שהאלקטרודה מוכנסת למיקרופיפטה. קח תא אלקטרופורציה המכיל קטע היפוקמפוס דק במיוחד שקוע בנוזל מוחי מלאכותי.

טבלו את האלקטרודה הקרקעית בנוזל הקיים בתא לצורך אלקטרופורציה לאחר מכן. הורד את קצה הפיפטה לתוך תא האלקטרופורציה ורשום את ההתנגדות הבסיסית. השתמש במיקרוסקופ כדי למקם את קצה הפיפטה ליד תא המטרה. ברגע שהפיפטה נמצאת במגע עם הממברנה העצבית, ההתנגדות שלה עולה בחדות.

הפעל לחץ אוויר חיובי כדי ליצור פלישה קטנה בקרום העצבי. הפעל במהירות שאיבה עדינה כדי לדחוף את הממברנה כלפי מעלה, וליצור אטימה רופפת בין קצה הפיפטה לממברנה. חזור על תהליך זה עוד כמה פעמים כדי לרכך את הממברנה ולהימנע מליזיס תאים.

לאחר המיזוג, יש למרוח יניקה חזקה ליצירת אטימה הדוקה עם קרום הנקרא אטם ג'יגהום. השתמש בפולסים חשמליים כדי ליצור נקבוביות חולפות באזור האטום של הממברנה. פתחים אלה מקלים על כניסת פלסמידים לתוך הנוירון הממוקד. לאחר אלקטרופורציה, הנקבוביות נאטמות מחדש, ולוכדות פלסמידים בתוך הנוירון.

להכנת תרביות פרוסות לאלקטרופורציה, העבירו את תוספות התרבות המעניינות לצלחות פטרי בודדות בגודל 3 סנטימטר עמוסות ב-900 מיקרוליטר של מדיום תרבית והניחו את התרביות בחממת פחמן דו חמצני על השולחן. לאחר מכן, תוספות תרבית טרייה לפני הדגירה עם 1 מיליליטר של מדיום תרבית פרוסות לכל תוספת בצלחת פטרי בגודל 3.5 ס"מ למשך 30 דקות לפחות, ועיקרו את קווי אסדת האלקטרופורציה עם אקונומיקה של 10% למשך 5 דקות.

בתום הזלוף, שטפו את הקווים במים המיוננים למשך 30 דקות לפחות לפני החדרת aCSF מעוקר בפילטר המכיל 0.001 טטרודוטוקסין מילי-מולרי. הגדר את דופק האלקטרופורטור למשרעת של מינוס 5 וולט, פולס מרובע, רכבת של 500 אלפיות השנייה, תדר של 50 הרץ ורוחב פולס של 500 מיקרו-שניות. מלאו פיפטה מזכוכית ב-5 מיקרוליטר של תמיסה פנימית המכילה פלסמיד והחליקו בעדינות והקישו על הקצה מספר פעמים כדי להסיר בועות כלואות.

השתמש במיקרוסקופ חיתוך כדי לוודא שהקצה אינו פגום והצמד היטב את קצה הפיפטה לאלקטרודה. כאשר הקצה יוצר מגע עם ה-aCSF, רשום את קריאת התנגדות הפיפטה של האלקטרופורטור. כדי לבודד תרבית פרוסה, חותכים את קרום הכנסת התרבות עם להב חד והשתמש במלקחיים בזווית חדה כדי להעביר בזהירות את תרבית הפרוסות לתא האלקטרופורציה. לאחר מכן, תקן את מיקום התרבות עם עוגן פרוסה.

לצורך אלקטרופורציה של התאים המעניינים, הפעל לחץ חיובי על הפיפטה דרך הפה והשתמש בפקדי הכפתור התלת מימדיים כדי לתמרן את קצה הפיפטה קרוב לפני השטח של תרבית הפרוסות. בצפייה בתרבית במיקרוסקופ, התקרב לתא המטרה עם הקצה, תוך שמירה על הלחץ החיובי המופעל עד שנוצרת גומה על פני התא. עם הדמיה של הגומה, הפעל במהירות לחץ שלילי קל דרך הפה כך שייווצר אטימה רופפת בין קצה הפיפטה לקרום הפלזמה.

הממברנה תיכנס מעט לפיפטה. יש להבחין בעלייה של פי 2.5 בערך בהתנגדות הראשונית של הפיפטה, כפי שמצוין על ידי עלייה בטון מהרמקולים. הפעל מחדש במהירות לחץ חיובי כך שהגומה תשתנה. לאחר מכן, השלם מיד לפחות שני מחזורי לחץ נוספים כפי שהודגם זה עתה ללא הפסקה. לאחר דופק הלחץ האחרון, החזק את הלחץ השלילי למשך שנייה אחת. הטון מהרמקולים מגיע לשיא יציב בגובה הצליל. השתמש בדוושת כף הרגל כדי לדופק במהירות את האלקטרופורטור.

לאחר האלקטרופורציה, החזירו בעדינות את הפיפטה כ-100 מיקרון מהתא מבלי להפעיל לחץ והפעילו שוב לחץ חיובי, וודאו שההתנגדות דומה לקריאת קו הבסיס לפני שמתקרבים לתא הבא. לאחר שכל התאים המעניינים עברו אלקטרופורציה, העבירו את תרבית הפרוסות לאחת מתוספות התרבית הטריות המוכנות והניחו את התוספת בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים.