בידוד נוירונים בחוט השדרה: הליך שיפוע צפיפות לבידוד נוירונים בעמוד השדרה בילודים למחקרי מבחנה

כדי לבודד תאי עצב בחוט השדרה, קחו עמוד שדרה של עכבר שזה עתה נולד והניחו אותו על צלחת פטרי. שטפו את עמוד השדרה עם מאגר מלח כדי לשחרר את חוט השדרה. להעביר את חוט השדרה למדיום עצבי קר כדי לקדם את הישרדות התאים.

לאחר מכן, טחנו את חוט השדרה והעבירו את השברים לצינור המכיל מדיום עצבי טרי. דגרו את הצינור באמבט מים שייקר לצורך התאקלמות. לאחר הדגירה, הסר את המדיום המושקע והוסף את מדיום העיכול. אנזימי עיכול מבקעים את מטריצת הרקמה כדי לשחרר את התאים.

בצע טריטורציה על ידי שאיבת שברי הרקמה לתוך הפיפטה ורוקן במהירות את הרכיבים, תוך שחרור תאים בודדים לתרחיף. לאחר מכן, העבירו את המתלה הזה לצינור המכיל מדיום שיפוע צפיפות וצנטריפוגה.

לאחר הצנטריפוגה, השכבה השטחית של הצינור מכילה פסולת רקמות. השכבה הראשונה כוללת אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים. השכבה השנייה והשלישית מורכבות מנוירונים, כאשר השכבה השלישית היא בעלת הטוהר הגבוה ביותר. לבסוף, הגלולה מכילה תאי מיקרוגליה.

אוספים את השכבה השלישית לצינור טרי ומוסיפים מדיום עצבי כדי לדלל את מדיום שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה לגלולה של הנוירונים. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בתווך נוירו-בסיסי כדי לשמר את הנוירונים לניסויים נוספים.

כדי להתחיל בהליך זה, הפרד את הראש מגופם של גורי העכברים שהורדמו באמצעות מספריים. לאחר מכן, ייצב את הזנב והזרועות על שולחן ההליכים כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, חתכו את העור בעזרת מספרי הקשתית המעוקלת. לאחר מכן, חתכו את חוט השדרה מאזור המותני ממש מעל הירכיים ואז חתכו את שני צידי בית החזה כדי להפריד אותו מהגוף.

שטפו את הדגימות ברצף בשלוש צלחות פטרי בגודל 10 סנטימטר המכילות 5 מיליליטר PBS מעוקר למשך 10 שניות כל אחת כדי להסיר רקמות עודפות. לאחר מכן, הכנס מחט ומזרק בגודל 22 מלא ב-5 מיליליטר PBS מעוקר לקצה הזנב של עמוד השדרה ושטוף בגולגולת, מה שמאפשר לחבל הבור לצאת לצלחת פטרי רביעית.

העבירו את חוט השדרה בצינור של 15 מיליליטר עם 5 מיליליטר HABG על קרח. הימנע מריסוק חוט השדרה וחזור על ההליכים עבור שאר הגורים. באופן אידיאלי, תהליך זה אמור להימשך לא יותר מ-30 דקות עבור קבוצה אחת של גורים כדי להבטיח בידוד בריא של תאי עצב.

להכנת שיפוע הצפיפות, הכינו כל אחת מארבע השכבות בארבעה צינורות של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר מכל שכבה לצינור חדש של 15 מיליליטר. מתחילים בשכבה 1 בתחתית ומוסיפים ברצף עד שמגיעים לשכבה 4 בחלק העליון. הימנע מהפרעה לשכבות בזמן ההוספה וכל תנועה נמרצת שעלולה לגרום לערבוב. לאחר מכן, הוסף את אמצעי העיכול לרקמה הטחונה. מניחים את הדגימה בשייקר באמבט המים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוציאו את הטישו מאמבט המים והניחו לו להתייצב מספר דקות.

כדי לבצע טריטורציה, שאפו את מדיום העיכול העודף. השעו את הרקמה ב -2 מיליליטר HABG. בעזרת פיפטה צרה, יש לשלש 10 פעמים תוך 45 שניות ולהימנע מהכנסת אוויר מכיוון שזה יפחית משמעותית את התשואה הקיימת. טריטורציה היא אחד השלבים הקריטיים ביותר בהליך. יש לשאוב את הרקמה בזהירות לתוך הפיפטה המלוטשת באש ולרוקן ממנה, תוך הימנעות מעודף מרץ, שעלול להוביל למוות עצבי, או להיות עדין מדי, מה שיגרום לתשואה נמוכה.

לאחר מכן, שאפו את 2 המיליליטר העליונים של הסופרנטנט והעבירו אותו לצינור חדש של 15 מיליליטר שכותרתו "אוסף". חזור על הליכי האיסוף פעמיים נוספות כדי להניב 6 מיליליטר של סופרנטנט. לאחר מכן, העבירו לאט את תוכן צינור האיסוף לצינור השיפוע שהוכן בעבר, והימנעו משיבוש השיפוע.

כדי לטהר את הנוירונים, צנטריפוגה את צינור השיפוע למשך 15 דקות בטמפרטורה של 800 x g ו-22 מעלות צלזיוס. אוספים את השכבות הרצויות ומעבירים אותן בצינור חדש של 15 מיליליטר. לבידוד נוירונים בטוהר הגבוה ביותר, אסוף שכבה 3. לקבלת תשואה רבה יותר עם פחות טוהר, יש לאסוף שכבות 2 עד 3.

לאחר מכן, יש לדלל את שיפוע הצפיפות על ידי הוספת 5 מיליליטר HABG לשכבות החדשות שנאספו. צנטריפוגה בחום של 200 x גרם למשך 2 דקות בחום של 22 מעלות צלזיוס. לאחר 2 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-5 מיליליטר של HABG על ידי תנועת הגלולה. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-200 x גרם למשך 2 דקות ב-22 מעלות צלזיוס שוב. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-3 מיליליטר של תווך נוירו-בסיסי על ידי תנועת הגלולה.