הזרקת מיקרו-בועות לעוברי עכברים מבודדים: טכניקה להעברת חומרי ניגוד מיקרו-בועתיים לתוך כלי הדם של עוברי מורין חיים

לאספקת מיקרו-בועות, התחל עם תרחיף אחיד של מיקרו-בועות בעלות מעטפת שומנים ממוקדת תאי אנדותל הכוללות ליבה גזית במזרק המחובר לצינור.

טען את המכלול הזה למשאבת מזרק והצמד מחט זכוכית לצינור. כעת, העבירו עובר עכבר מקורר המבטא קולטני תאי אנדותל ספציפיים לתוך צלחת המונחת על במת סטריאוסקופ.

הוצא בעדינות את העובר משק החלמון וקרום מי השפיר. אבטח את השק ואת קצוות השליה. שטפו את העובר עם חיץ חם כדי להחזיר את זרימת הדם שלו. מכסים את העובר בג'ל אולטרסאונד מחומם מראש להעברת גלי אולטרסאונד אופטימלית. יש ליטול תוסף עם בופר כדי לשמור על מצבו הפיזיולוגי.

הזרקו בזהירות את תרחיף המיקרו-בועות בקצב הזרימה הרצוי לווריד מתאים על פני קרום העובר של דיסק השליה באמצעות משאבת המזרק. המיקרו-בועות המוזרקות עוברות במחזור הדם ונקשרות לקולטנים הספציפיים בתאי האנדותל המצפים את כלי הדם.

השתמש במתמר אולטרסאונד כדי להעביר גלי אולטרסאונד בתדר גבוה לעובר. ליבות הגז הדחיסות מאוד של המיקרו-בועות גורמות להן להתנודד באופן לא ליניארי, ומפזרות גלי אולטרסאונד בתדרים שונים מהגלים המתרחשים. אותות אלה והאותות הליניאריים של הרקמה חוזרים למתמר.

המתמר מעביר אותם למערכת הדמיה המבדילה בין האותות המפוזרים במיקרו-בועה לבין אותות הרקמה, ומייצרת תמונות אולטרסאונד משופרות ניגודיות של כלי הדם העובריים.

פיפט את הנפח הדרוש של תמיסת מלאי מיקרו-בועות והוסף לכמות המלח. מערבבים על ידי ערבוב עדין עם קצה הפיפטה. לאחר מכן, השתמש במחט בגודל 21 כדי לשאוב את תמיסת המיקרו-בועות המדוללת למזרק נקי. לאחר הסרת המחט, הסר את כל בועות האוויר מהמזרק והצמד את הלואר והצינור. דחף לאט את התמיסה לקצה הצינור, וודא שלא תיצור בועות אוויר.

לבסוף, הכנס את המזרק למשאבת עירוי מזרק המוגדרת להפצת המיקרו-בועות בקצב של 20 מיקרוליטר לדקה לנפח כולל של 20 מיקרוליטר. חבר מחט זכוכית משוכה לקצה הצינור. הזז את המשאבה קרוב לשלב ההזרקה. השתמש בכף מחוררת כדי לבחור ולהוציא באופן אקראי עובר אחד מצלחת המדיה המצוננת. הניחו את העובר בצלחת דיסקציה הממוקמת על במת האולטרסאונד מתחת לסטריאוסקופ.

לאחר מכן, אתר את הצד של העובר שנראה הכי פחות כלי דם. הנה אזור של כלי דם נמוכים, בדרך כלל צמוד לאזור הראש. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי לחתוך או לקרוע מספיק משק החלמון ומממברנות מי השפיר כדי שתוכל להוציא את העובר מבפנים, אך לא יותר. לאחר מכן, תמרן בעדינות את השק מסביב לעובר. לאחר מכן, מקם את העובר על צדו כשהשליה וכלי הטבור מלפנים.

ייצב את צלחת החיתוך באמצעות חתיכות פלסטלינה קטנות. בעזרת ארבעה סיכות חרקים, הצמידו את שק החלמון ואת שולי השליה, הימנעו מכל כלי דם גדולים. בעזרת מזרק המכיל PBS מחומם מראש של 45 מעלות צלזיוס, שטפו את העובר עד שניתן לראות דם זורם לתוך העובר. עורק הטבור מזוהה על ידי הדם האדום הבוהק והפועם. לווריד הטבור ולרשת כלי הדם הקשורה אליו יש דם כהה יותר ובדרך כלל מכסים את אלה מעורק הטבור בצד השליה.

בשלב זה, מקם את המנה כך שניתן יהיה לבצע את ההזרקה בנוחות. לאחר שהעובר התעורר לחיים, כסו אותו, אך לא את השליה, בג'ל אולטרסאונד שחומם מראש. השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר בעדינות בועות אוויר מסביב לעובר ומלא את המנה ב-PBS מחומם מראש. לאורך כל ההליך, יש לפקוח עין על רמת התמיסה במזרקי PBS וג'ל ולהוסיף מזרקי גיבוי לכוס החימום לפי הצורך.

לאחר מכן, הרכיב את מחט הזכוכית על כדור פלסטלינה גדול בקצה צלחת הדיסקציה והכנס את קצה המחט לתוך ה- PBS. בחר וריד על המשטח הכוריוני של דיסק השליה רחוק ככל האפשר מהענף הראשי. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לקצץ את קצה המחט כך שיתאים לגודל הכלי, וחתוך את הקצה בזווית קלה. השתמש בקצה המספריים הקפיציים כדי להסיר קצוות זכוכית משוננים.

כעת, באמצעות משאבת המזרק, הזריקו לאט את תמיסת המיקרו-בועות במהירות של 20 מיקרוליטר לדקה לתוך מחט הזכוכית עד שכל האוויר נפלט מקצה המחט וניתן לראות את המיקרו-בועות זורמות בחופשיות לתוך ה-PBS. עצור את המשאבה ואפס אותה לנפח הזרקה של 20 מיקרוליטר. אל תאפשר לאוויר להיכנס למחט ההזרקה כדי למנוע הזרקת אוויר למערכת כלי הדם של העובר.

הכנס את קצה מחט הזכוכית בעדינות לווריד שנבחר בשליה וודא שהוא לא זז. סובב את ראש הסטריאוסקופ ומקם את מתמר האולטרסאונד כך שהעובר ממוקם באופן שווה בין המוקדים בגובה 6 עד 10 מילימטרים. לאחר מכן, התחל הדמיה והתחל בהזרקת הבולוס של המיקרו-בועות. לאחר דקה, לאחר השלמת ההזרקה, הפעל את הטיימר לשלב רכישת הנתונים.