בידוד תאי אינטרסטיציאל של שסתום עכבר: שיטה אנזימטית לבידוד ותרבית VICs ממסתם אבי העורקים של העכבר

המסתם האאורטלי של הלב הוא מבנה תלת-עלוני המורכב מתאי הביניים של המסתם הפנימי או VICs המפוזרים ברחבי המטריצה החוץ-תאית הצפופה ותאי האנדותל של המסתם שמעליו.

כדי לבודד VICs, ראשית, הכינו עכבר שעבר המתת חסד במצב שכיבה. דרך חתך בטן וחזה בקו האמצע, חשוף את הלב. עשו חתך קטן בין הפרוזדור השמאלי לחדר ואחריו זלוף מי מלח כדי לנקז את הדם. חתכו את אבי העורקים העולה בגובה קשת אבי העורקים וקצרו את הלב.

יש לחצות ולהשליך את שני השלישים הדיסטליים של החדרים לפני שתנתח לאורך את החלק הנותר של הלב כדי לחשוף את עלוני המסתם האאורטלי 'בצורת U'. כורתים את העלונים ושוטפים עם חוצץ צונן כדי להסיר דם.

לאחר מכן, טפלו בעלונים בתמיסת קולגנאז מרוכזת נמוכה ודגרו. בריכוזים נמוכים, קולגנאז - אנזים פרוטאוליטי - מפרק רק חלקית את המטריצה החוץ-תאית, ומעביר VECs פני השטח מהעלים.

צנטריפוגה והחלף את הסופרנטנט המכיל אנזים במאגר, והעביר את הכדור המרחף לצלחת פטרי. אוספים את העלונים ומטפלים בהם בתמיסת קולגנאז מרוכזת גבוהה לעיכול שני. עם הדגירה, קולגנאז מפרק עוד יותר את המטריצה החוץ-תאית, ומשחרר VICs לתמיסה.

צנטריפוגה לכדור ה-VICs ולהשעיה מחדש במדיה מתאימה. לבסוף, זרעו נפח נמוך של תרחיף התאים על צלחת מרובת בארות כדי להקל על היצמדות ה-VICs לתחתית הבאר. דגירה כדי לאפשר ל-VICs להתרבות.

לפני תחילת הניסוי, יש לנקות ולעקר את כל המכשירים הכירורגיים וסביבת העבודה עם 70% אתנול ולבצע חיטוי של מכשירי הניתוח למשך 30 דקות. כאשר ההתקנה הראשונית מוכנה, התחל בניקוי החזה ואזור הבטן של עכבר בן 8 שבועות שהורדם באמצעות אתנול.

בעזרת מספריים פתח את הבטן ואת החזה של העכבר. לאחר מכן, חתכו בין האטריום השמאלי לחדר השמאלי בעזרת מספריים כירורגיים קטנים. הסר דם מהלב על ידי החדרת 10 מיליליטר PBS קר וחתוך את הלב תוך שמירה על 3 מילימטרים של אבי העורקים העולה. תחת סטריאומיקרוסקופ, נתח את המסתם האאורטלי על ידי חיתוך הלב אופקית באמצע החדרים וחיתוך החדר השמאלי לכיוון אבי העורקים. לאחר מכן, נתח בזהירות את המסתם האאורטלי. אסוף את השסתומים יחד בצלחת תרבית רקמה קטנה בגודל 35 מילימטר.

שוטפים את השסתומים המבודדים בכלי תרבית תאים של 75 מיליליטר עם 5 מיליליטר HEPES קר טרי של 10 מילי-מולרית בתוספת אנטיביוטיקה ודוגרים ב-5 מיליליטר קולגנאז מסוג I למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור מתמשך. לאחר הדגירה, יש לצנטריפוגה את הצינור למשך 5 דקות ב-150 x גרם ולשטוף את הגלולה פעם אחת עם 2 מיליליטר HEPES מילי-מולרי עם מערבולת במהירות גבוהה למשך 30 שניות.

אוספים את התרחיף שנוצר מהצינור לתוך צלחת תרבית בגודל 35 מילימטר ומשתמשים בפינצטה דקה כדי להעביר בזהירות את שברי הרקמה לצינור טרי. לאחר מכן, דגרו את הגלולה בצינור של 15 מיליליטר ב-5 מיליליטר קולגנאז מסוג I ב-37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמשכת למשך 35 דקות. הפרד את התאים על ידי השעיה מחדש עם פיפטה של 1 מיליליטר וצנטריפוגה ב -150 x גרם למשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. נקו את התאים פעמיים על ידי השעיית הגלולה המופרדת ב-2 מיליליטר של DMEM מלא וצנטריפוגה ב-150 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

לציפוי, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום שלם והוסיפו אותה לבאר אחת של צלחת תרבית תאים עם 6 בארות בכמות מינימלית של מדיום. שמור על הצלחות ללא הפרעה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 3 ימי דגירה, אשר צמיחה קרוב יותר לפסולת רקמות על ידי התבוננות בתאים תחת המיקרוסקופ. לאחר ש-1,000 תאים נראים לעין, הסר בזהירות את שאריות הרקמה בעזרת פינצטה אוטוקלאב והחלף את המדיום.