Name: עכבר בתוך הרחם Electroporation: גין מבוקרת transfection Spatiotemporal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למדו שיטת אלקטרופורציה בתוך הרחם לשתילת גנים במוח העוברי של עכברים. טכניקה זו מאפשרת שליטה מרחבית וזמנית בזרימת DNA לשכבות קורטיקליות ומבנים עמוקים כמו התלמוס וההיפותלמוס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומנה על ידי המכון למדעי המוח RIKEN (BSI), תוכנית האדם Frontier Science (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN תוכנית ג&#39;וניור עמית מחקר (JRA, העניק לח&quot;כ) RIKEN המכון למדעי המוח (BSI), תוכנית אנוש המדע Frontier (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN עמית ג&#39;וניור תוכנית המחקר (JRA, העניק לח&quot;כ) מימנה את העבודה הזאת.

1. הכנת פתרון נימי ו-DNA להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA פלסמיד עם הכנה, מקסי או בשיטה שוות ערך, ולעשות ריכוז סופי של 2-3 מיקרוגרם / μl. Aliquot 100 מיקרוגרם של ה-DNA, להוסיף 10μl מהיר של צבע ירוק (1% מניות) ו TE (10mm טריס הבסיס, 1mm פתרון EDTA, pH 8.0) ולהתאים נפח μl 100 על מנת להפוך את ריכוז ה-DNA הסופי לערבב זריקה כדי 1μg / μl. ריכוז ה-DNA פלסמיד יכול להיות שונה תלוי בגודל של הפלסמיד, כמו גם יעילות transfection שלה, אשר צריך להיבדק לגופו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הפתרון DNA במשך 5 דקות ב 14,000 סל"ד בטמפרטורת החדר לאסוף supernatant כדי להסיר שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כוס זכוכית נימי צינורות tubea נימי באמצעות חולץ micropipette. לצבוט את הקצה עם מלקחיים כדי להטות את בעל קוטר 20-30 מיקרומטר. מדד 800 מיקרומטר-1 מ"מ מקצה לבדוק את קוטר חיצוני הוא פחות מ 60 מיקרומטר (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את נימי micromanipulator, ולמלא עם שמן מינרלי. כדי למלא את נימי עם פתרון ה-DNA, לצלול לתוך קצה הפתרון ולמצוץ את פתרון ה-DNA. </li></ol> 2. סטיק אלקטרודות פלטינה כאן השתמשנו פלטינה מקל אלקטרודות (Nepe גן, CUY611P2-1) כדי electroporate לאזור שטחיים של המוח, כמו קליפת המוח (איור 1F). 3. הכנת מיקרו אלקטרודות השתמש מיקרו אלקטרודות electroporated לחלקים העמוקים של המוח (כלומר, התלמוס וההיפותלמוס) (איור 2 ב-E). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה אחד של טונגסטן (עבור אלקטרודות שליליות) ופלטינה (עבור אלקטרודות חיוביות) על חוטי הוא מפותל מצופה זהב סיכות קבוע עם parafilm. הכנס את החוט גזע של מקלון צמר גפן לעטוף את שני הקצוות עם parafilm (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שווה לחדד את קצה החוט עם נייר זכוכית עד שהוא מגיע 20-30 מיקרומטר קוטר חיצוני 60 מיקרומטר מ 800 מיקרומטר-1 מ"מ של קצה (איור 1C ו-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעיל דק של לק על חוט לבידוד. לאחר לק התייבש, להשתמש ספוגית צמר גפן ספוג אצטון כדי להסיר אותו מקצה (כ 200 מיקרומטר מקצה). הערה חשובה: כדי למנוע נזק הרחם של העכבר, את החלק בתוך 800 מיקרומטר-1 מ"מ של קצה צריך להיות לא יותר מ 70 מיקרומטר קוטר (איור 1E). </li></ol> 4. הכנת הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בהריון (E9.5-E15.5). אנו מדגימים הרדמה עם התרופות כיתה pentobarbital נתרן (לוח השנייה; 50 מיקרוגרם לכל גרם משקל גוף, להזריק intraperitoneally ולחכות 5 דקות). חלופות נתרן pentobarbital כחומר הרדמה כוללות הזרקת קטמין / Xylazine הרדמה או גז (גז עדיף נהלים זמן קצר). הזריקה צריכה להיעשות תוך תשומת לב כדי למנוע איברים, אחרת זה יגרום נזק הרחם או להרוג בעלי חיים. כאשר ה-IP מוצלח נעשה, שיעור ההישרדות הוא יותר מ -95%. כמו כן, הניתוח יכול להתבצע בסביבה באוויר הפתוח. בטרם החל המבצע הבדיקה, על חוסר התגובה של החיה כדי צובט הבוהן שלהם כדי לאשר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את שיער מהבטן באמצעות סכין גילוח ו EtOH 50%. הכינו את העור לסירוגין סקראבס של בבטאדין ואלכוהול (70%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך בכל קו האמצע הבטן במספריים דק ולהוציא את כל הקרניים הרחם בזהירות על 37 מעלות צלזיוס מראש חימם פוספט בופר סליין (PBS), לחלח גזה כותנה, אשר ממוקם באזור הפצע. שמרו על לחות הרחם עם PBS כל הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק כבל סיב אופטי גמיש בין המדד לבין האצבעות באמצע ולמקם אותו תחת קרן הרחם. כבל נקי עם EtOH 70% לפני השימוש. לא מיקרוסקופ או זכוכית מגדלת נדרשת ראיה. מיקום הרחם בין כבל סיב אופטי אור אופטיים את האגודל, וסוחטים בעדינות לדחוף את העובר קרוב לקיר הרחם. </li></ol> 5. הזרקה של DNA electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העובר ממוקם, הכנס זכוכית נימי בזהירות לתוך החדר היעד להזריק 1 כ μl של פתרון ה-DNA (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור electroporation לחלק השטחי של brainIf באמצעות אלקטרודות פלטינה עם מקל electoporation, במקום אלקטרודות מחוץ לרחם וליישם הציע גל מרובע פעימות הנוכחי על פי הוראה של ייצור (טבלה I). אם electroporation usingFor לחלק עמוק יותר של המוח, electroporation nmicro, אלקטרודות סוג eedle משמשים. Iinsert אלקטרודה טונגסטן בסדר שלילי מוזרק לתוך ה-DNA החדר ואת אלקטרודת פלטינה לתוך הרחם היעד באזור מקום בין שתי אלקטרודות, ולאחר מכן להחיל הציע גל מרובע פעימות הנוכחי (טבלה I) (איור 2 ב). </li></ol> 6. הודעה electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את גב קרן הרחם ב 'מקורית שלהמיקום inal עם ולהוסיף 500 μL של 37 ° C טרום חימם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את השכבה הפנימית עם תפר כירורגית השכבה החיצונית הדוק עם קליפ autoclipauto 9 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי המקום על כרית חימום למשך 2 שעות, כדי לאפשר ההתאוששות מן ההרדמה. משככי כאבים כגון carprofen או עצירות יכולה להינתן על הכאב שלאחר הניתוח. </li></ol> 7. נציג התוצאות: כמה דוגמאות של electroporation קליפת המוח של pCAG-EYFP לבנות באמצעות אלקטרודות פלטינה מקל בנקודות זמן שונות מוצגות באיור איור 32. מוחות הם electroporated ב E13.5, E14.5 ו E15.5, וקצרו ביום הלידה (P) 6. AThe מכתים ntibody של RORc מגלה עמדתו של שכבת 4 ואת המיקום של תאים EYFP transfected מתגלים כתמים על ידי נוגדן ה-GFP, והתמונות הן סופר שהוטל (איור 3A ו-B). תאים בקליפת המוח תווית הם שכבה של תאים בקליפת המוח electroporated הוא בבירור שונה בכל ניסוי (איור 32), אשר טוען תלוי זמן electroporation קליפת המוח הופכת שכבת ספציפי GOF / LOF אפשרי. הכדאיות של עוברים והיעילות של transfection התא משתנה בהתאם לגיל העובר ואת המיקום של electroporation. דוגמאות מפורטות על טבלה מס '1, לעומת זאת, התנאים צריכים להיות מותאמים לכל electroporation בהתאם הבמה חלק של המוח. Electroporation לתוך רקמות עמוק כגון התלמוס וההיפותלמוס עם פלטינה באמצעות אלקטרודות מקל לעתים קרובות לתת יעילות נמוכה (טבלה 1). בעיה זו ניתן לפתור באמצעות מיקרו אלקטרודות whichelectrodes, אשר תגיע לחלקים העמוקים של המוח. איור 3 4 מראה דוגמה electroporation pCAG-EYFP לתוך diencephalon המתפתח. פתרון ה-DNA פלסמיד מוזרק לתוך ה -3 החדר בבית E11.5 ואחריו מיקרו electroporation (איור 3C4C). האזור electroporated מוגבל בתלמוס שבה רוב הפרויקט אקסונים אל הקורטקס (איור 3B4B). הקרנת אקסון לשכבה 4 של קליפת ניתן דמיינו גם EYFP, אשר fillesfills את נוירון כולו. (איור 3A4A). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סכמטית Cartoon הוכחת את הצורה הנכונה של נימי. (א) צינור זכוכית נימי הוא משך באמצעות חולץ micropipette לעשות צורה מסוימת. טיפ כבוי צבט ידי מלקחיים כדי לעשות את זה 20-30 מיקרומטר. מדד 800 מיקרומטר-1mm מקצה (סוגר אדום) ולוודא כי קוטר חיצוני הוא פחות מ 60 מיקרומטר (סוגר ירוק). (ב) קצה אחד של טונגסטן או חוטי פלטינה הוא מפותל על מצופה זהב סיכות קבוע עם parafilm. ואז להשתמש בנייר חול לבצע קצה שלהם להפוך 2-30 קוטר חיצוני מיקרומטר ו 60 מיקרומטר 1 מ"מ של קצה. (ג) תמונה של חוט טונגסטן לפני בעיצוב. (ד) תמונה של חוט טונגסטן לאחר עיצוב. (ה) תמונה של חוט טונגסטן לאחר החלת מעיל דק של לק. בר סולם ב E הוא 10 מיקרומטר (בקנה מידה קטן) עבור לספירה. (F) פלטינה Stick אלקטרודות (גן Nepa. CUY611P2-1). בר סולם בפה הוא 2 מ"מ. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Cartoon סכימה של הליך כירורגי. (א) תרשים של הזרקה לתוך החדר לרוחב או עוברי גדול (צד שמאל) לתוך החדר ה -3 או עוברי קטן (צד ימין). (ב) תרשים של electrporation ידי אלקטרודה פלטינה מקל (צד שמאל) על ידי אלקטרודה מחט סוג (צד ימין). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. פיתוח עכבר telencephalon היה electroporated עם pCAG-EYFP E13.5 ב (א), E14.5 (B) E15.5 (C) שנקטפו ב P6. המוח נותחו העטרה ומוכתמת עם נוגדן GFP או נוגדן RORc בנפרד ותמונות ימוזגו. (א) electroporation של pCAG-EYFP פלסמיד ב E13.5 transfect 4 נוירונים רבים בשכבה. אשר חפיפה עם שכבת סמנים RORc 4. (ב) electroporation של pCAG-EYFP פלסמיד ב E14.5 תאים transfect, שהם שטחיים יותר שכבה 4 נוירונים. (ג) E15.5 תווית electroporation נוירונים שטחית רבים כגון שכבה 2 / 3. סולם בר 200 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. Transfection של EYFP לתוך thalamo-קליפת המוח אקסונים (TCA). (א) הסופית TCA בשכבה קורטיקליים 4 מתגלה על ידי מכתים נוגדן ה-GFP. מכתים RORc הנוגדן משמש כדי לחשוף את המיקום של שכבה 4. התמונות הן לקוחים סעיף זהה הממוזג. (ב) קבוצה של electroporation אל התלמוס מוצג גם על ידי צביעת נוגדן ה-GFP ו מכתים RORc, אשר הביטוי מוגבל של התלמוס 11. (ג) סכמטית Cartoon עבור electroporation thalamic והשלכה TCA מוצגים. סולם בר 200 מיקרומטר.

<ol><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes+genes+and+neurogenin+regulate+non-neural+versus+neural+fate+specification+in+the+dorsal+telencephalic+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline.</a> Development. 135, 2531-2541 (2008).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li>
<li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTakahashi%2C+Y+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).</li>
<li>Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).</li>
<li>Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally-controlled+site-specific+mutagenesis+in+the+basal+layer+of+the+epidermis%3A+comparison+of+the+recombinase+activity+of+the+tamoxifen-inducible+Cre-ERT+and+Cre-ERT2+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases.</a> Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).</li>
<li>Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterned+expression+of+orphan+nuclear+receptor+genes+ROR+alpha+and+ROR+beta+in+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain.</a> Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בפרוטוקול זה, אנחנו רק תיאר היתרונות של השיטה של ​​transfection pCAG-EYFP לאזור המוגבל של מוח העובר קטן באמצעות אלקטרודות בצורת שונות. לשם השוואה של יעילות transfection על ידי האמרגן שונה שתואר לעיל, אשר מציגה סוג תא סגוליות 1. עם זאת, ישנן מגבלות על הטכניקה, כגון transfection הוא חולף רק משתנה תלוי פלסמיד, אין לו שום ייחוד תא וקשה לשלוט במספרים של תאים transfected. ThereforeHowever, שילוב של פרוטוקול זה עם טכניקות אחרות יהיה עוד לספק אפשרויות שיטות מניפולציה שונות. ראשית, שילוב מקדם תאים ספציפיים לתוך פלסמיד דנ&quot;א יאפשר לתא מסוג transfection ספציפיים, כגון נוירונים ותאי גלייה ו האסטרוציטים. שנית, מאז transfection הוא חולף, זה לא מתאים מדענים שרוצים לנתח את הפונקציה של הגן בשלב מאוחר יותר בחיים. לכן, בשילוב עם transposase לעשות פלסמיד דנ&quot;א להשתלב בגנום יהיה להמיר אותו לתוך transfection יציב 8. האימוץ הבא של ט או ט את המערכת תאפשר לתפעל את העיתוי או סוג תא ספציפי ביטוי גנים בתאים עצביים 8. לחלופין, אפשר לשלב את זה עם פרוטוקול ועין מתנהלת-טמוקסיפן Cre-ER (T) recombinases 9 ועכברים הכתב 10. זו נגישות רחבה של רקמות יהיה דרסטי לשנות עיצובים ניסיוניים בשימוש במדעי המוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> טונגסטן חשוף חוט בקוטר 125 מיקרומטר </td><td> AM מערכות </td><td> 797600 </td></tr><tr><td> פלטינה חשוף חוט בקוטר 125 מיקרומטר </td><td> AM מערכות </td><td> 767000 </td></tr><tr><td> סטיק אלקטרודות </td><td> Nepa גן </td><td> CUY610P4-1 </td></tr><tr><td> צינור זכוכית נימי </td><td> Stoelting </td><td> 50611 </td></tr><tr><td> micromanipulator </td><td> KD מדעי </td><td> KDS310 </td></tr><tr><td> מספרים </td><td> ROBOZ </td><td> RS-5865 </td></tr><tr><td> הדופק גנרטור </td><td> AM מערכות </td><td> דגם 2100 </td></tr><tr><td> 9 מ&quot;מ autoclip </td><td> ROBOZ </td><td> RS-9260 </td></tr><tr><td> מצופה זהב סיכות </td><td> WPI </td><td> 5482 </td></tr><tr><td> RORc נוגדן </td><td> פרסאוס Proteomics </td><td> H3925 </td></tr></tbody></table>

עכבר בתוך הרחם electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection spatiotemporal

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

על מנת להבין את תפקידם של גנים הביע באזור מסוים של המוח המתפתח, כולל מולקולות איתות והדרכה מולקולות האקסון, העברת גנים מקומיים או עקום החוצה נדרשת. ג&#39;ין מיקוד עקום או עקום החוצה לאזורים המקומי ניתן לבצע בשילוב עם קו Cre ספציפי, שהוא מייגע, יקר, זמן רב. לכן, שיטה transfection פשוט, טכניקה electroporation ברחם, אשר יכול להתבצע עם זמן קצר, יהיה בהישג יד כדי לבדוק את תפקוד אפשרי של גנים מועמדים לפני דור 1,2 חיות טרנסגניות. בנוסף לכך, ב electroporation ברחם מטרות אזורים במוח שבהם אין קו ספציפי Cre קיים, יגביל הקטלניות עובריים 3,4. כאן, אנו מציגים שיטה ב electroporation ברחם שילוב של שני סוגים שונים של אלקטרודות להעברת גנים קל ונוח לתחומי היעד של המוח המתפתח. ראשית, שיטת החזקה ייחודית של עוברים באמצעות סיב אופטי כבל אופטי אור יגרום עוברים קטנים (מ E9.5) גלוי להזרקה פתרון ממוקד דנ&quot;א לתוך החדרים וסוג אלקטרודות מחט הכניסה לאזור המוח ממוקד 5,6. דפוסים של המוח כגון אזור בקליפת המוח מתרחשת בשלב עוברי מוקדם, ולכן, אלה electroporation מוקדם E9.5 תרומה גדולה להבין את האירוע כולו דפוסים אזור. שנית, את הצורה המדויקת של נימי מונע נזק הרחם על ידי יצירת חורים על ידי הכניסה של נימי. יתר על כן, הצורה המדויקת של אלקטרודות מחט נוצרות עם טונגסטן חוט פלטינה חידד שימוש בנייר חול מבודד עם לק 7, שיטה אשר מתואר בפירוט רב בפרוטוקול זה. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד לאזורים מוגבלים של המוח יאפשר עוברי קטן להיות electroporated. זה יעזור, לפתוח חלון חדש של מדענים רבים שעובדים על התמיינות תאים, נדידת תאים, הדרכה האקסון עובריים בשלב מוקדם מאוד. יתרה מכך, טכניקה זו תאפשר למדענים transfect DNA פלסמיד לחלקים העמוקים של המוח המתפתח כגון התלמוס וההיפותלמוס, שם לא רבים ספציפיים באזור קווי Cre קיימים למטרות רווח של הפונקציה (GOF), או הפסד של (LOF) מנתח לתפקד.

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

על מנת להבין את תפקודם של גנים המבטאים את עצמם באזור ספציפי של המוח המתפתח, כולל מולקולות סיגנלינג והנחיית אקסונים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג טרנספקציית גנים יעילה במערכת העצבים המרכזית של עוברי עכברים בנקודת זמן התפתחותית ובאזור מוחי רצויים. מטרה זו מושגת ראשית על ידי הכנת קפילריות מדויקות ואלקטרודות מסוג מחט כדי למנוע נזק לרחם. השלב השני של הפרוצדורה הוא למידת שיטת החזקה ייחודית של עוברי עכברים באמצעות כבל תאורה אופטי כדי להדמיות עוברי עכברים קטנים לצורך הזרקת DNA ממוקדת.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע אלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות מסוג מקל על פני השטח של הרחם, כדי להחדיר DNA לחלקים השטחיים של המוח; השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע אלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות מסוג מחט למבנים עמוקים יותר של המוח, כגון התלמוס וההיפותלמוס. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות טרנספקציה ספציפית של השכבה הקורטיקלית או טרנספקציה יעילה בתלמוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הזרקה רגילה במקום, הוא בנראות רבה יותר ובשליטה גבוהה יותר על אתר ההזרקה של העוברים ברחם.אנו משתמשים בכבל דמוי סיב אופטי, המאפשר ויזואליזציה של עוברים החל מיום E 9.5 והחדרה של מחטים להעברת DNA פלסמידי לחלקים עמוקים יותר של המוח, כגון התלמוס וההיפותלמוס. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע למוח המתפתח, כגון בידול עצבי, דפוס התפתחות המוח וקישוריות עצבית. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקשיים, מכיוון שעיצוב המחט, האלקטרודה והשגת המיקום המדויק הן פעולות מורכבות.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי לראות כיצד להכין אלקטרודות מחט מדויקות וכיצ nào למקם עוברים כדי לבצע אלקטרופורזה. זאת מכיוון ששני שלבים אלו הם המפתח להשגת תוצאות מוצלחות. להכנת קפילריים, השתמשו בשוב מחסנרי מיקרו-פיפט (micropipet puller) בהתאם להוראות היצרן.בפרוצדורה זו, אנו משתמשים בצינורות קפילריים מזכוכית בקוטר מילימטר אחד ללא סיב פנימי. על מחטים משוכות להיות באורך של 800 מיקרומטר עד מילימטר מהקצה, עם קוטר חיצוני של פחות מ-60 מיקרומטר; השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה ובפינצטה כדי לקטוע את קצות המחטים לקוטר של 20 עד 30 מיקרומטר. מדדו כל מחט באמצעות מיקרומטר.בשלב הבא, הכין מיקרו-אלקטרודות באמצעות ליפוף. יש ללפוף קצה אחד של תיל טונגסטן סביב פין מצופה זהב. השתמש בתיל טונגסטן עבור אלקטרודות שליליות ובתיל פלטינה עבור אלקטרודות חיוביות.קבעו את התיל לפין באמצעות פאראם (param). לאחר מכן, הכניסו את התיל לתוך הגבעול הפלסטי של מקלון צמר גפן ועטפו את שני הקצוות ב-phim. שייפו באופן אחיד את קצה התיל בעזרת נייר זכוכית עדין עד שיגיע לעובי של 20 עד 30 micrometers בקצה, ו-60 micrometers במרחק של 800 micrometers עד מילימטר אחד מהקצה. בדקו שוב את הממדים הסופיים באמצעות מיקרומטר.בשלב הבא, טבלו את התיל המחודד לתוך טיפה של לק ציפורניים כדי למרוח שכבה דקה על פני התיל כולו לצורך בידוד. לאחר שהלק התייבש, השתמשו במקלון צמר גפן ספוג באצטון כדי להסיר אותו מ-200 micrometers האחרונים של קצה המקל. אלקטרודות פלטינה נרכשות כשהן מוכנות ואינן דורשות הכנה.בנוהל זה, אנו משתמשים ב-CUY six 10 P four dash one nepo gene electrode. טהרו את ה-DNA מהפלסמה באמצעות maxi prep או שיטה מקבילה, העבירו 100 micrograms של DNA למבחנה חדשה, והוסיפו 10 µL של צבע fast green בריכוז 1%. השתמשו ב-TE כדי להביא את הנפח ל-100 µL, עבור ריכוז סופי של 1 µg/µL של DNA מהפלסמה. ערבבו את התמיסה בעדינות באמצעות פיפטינג, ולאחר מכן סובבו את תמיסת ה-DNA במשך חמש דקות ב-14,000 RPM בטמפרטורת החדר כדי להסיר זיהומים ומלחים.העבירו את ה-SNAT למבחנה חדשה. ניתן לשמור את תמיסת ה-DNA במבחנה בטמפרטורת החדר לאורך כל הפרוצדורה. לאחר מכן, חברו מחט משוכה למיקרו-מניפולטור בהתאם להוראות היצרן, ושקעו את קצה המחט בתוך תמיסת ה-DNA כדי למלא את המחט.הניחי את המיקרו-מניפולטור בצד בזהירות והכיני את הציוד לפני הניתוח. שקלי עכברה ההרה בימי הריון 9.5 עד 15.5 כדי לקבוע את משקל הגוף.לאחר מכן, הזרקה תוך-peritoneum. מזריקים sodium pentobarbital בדרגת תרופתית במינון של 50 micrograms לגרם משקל גוף וממתינים חמש דקות. חלופות ל-sodium pentobarbital עשויות לכלול ketamine, xylazine, הזרקה או חומרי הרדמה גזיים.לאחר ההרדמה, השתמשו בתער וב-50% ethanol כדי לגגל את הפרווה מהבטן. הכינו את העור באמצעות קרצוף לסירוגין של Betadine ו-70% alcohol. בצעו חתך בקו האמצע של הבטן בעזרת מספריים עדינים.הוציאו בזהירות את כל קרני הרחם על גבי גזה של כותנה לחה ב-PBS (מלחים פוספטיים מאוזני pH) המונחת סביב הפצע. שמרו על הרחם לח באמצעות PBS לאורך כל הזמן. השתמשו בכבל סיב אופטי גמיש.הניחו את הכבל מתחת לקרן הרחם. מקמו את הרחם בין אור הסיב האופטי לבין האגודל ולחצו בעדינות כדי לדחוף את העובר כלפי מעלה, קרוב יותר לדופן הרחם. כאשר העובר ממוקם כך שהראש פונה שמאלה ולמעלה, הכניסו בזהירות את הנימיזיות הזכוכית אל תוך החדר המטרה והזריקו כ-1 µL של תמיסת DNA לאלקטרופורציה של שכבה 4 של קליפת המוח ביום עוברי 13.5.הניחו את אלקטרודות הפלטינה בצורת מוט מחוץ לרחם והפעילו פולסי זרם של גל ריבועי חמש פעמים במתח של 38 volts למשך 50 milliseconds. במידה ומשתמשים באלקטרופורציה מיקרוסקופית כדי להגיע לתלמוס או להיפותלמוס ביום עוברי 10.5, הכניסו את אלקטרודת הטונגסטן השלילית הדקה אל תוך המערכה (ventricle) שבה הוזרק ה-DNA ואת אלקטרודת הפלטינה החיובית אל תוך הרחם. מקמו את אזור המטרה בין הקצוות של שתי האלקטרודות והפעילו את פולסי זרם הגל הריבועי המוצעים שלוש פעמים במתח של שבעה volts למשך 100 milliseconds.לאחר השלמת האלקטרופורציה, החזירה את קרן הרחם למיקומה המקורי והוסף 500 µL של PBS. תפר את השכבה הפנימית של החתך באמצעות תפר כירורגי. לאחר מכן, סגור את השכבה החיצונית באמצעות אטוב-קליפ של תשעה מילימטרים.הנח את העכבר על פד חימום למשך שעתיים כדי לאפשר התאוששות מהניתוח ומההרדמה. כאן מוצגת אלקטרופורציה של הפלטינום באזור הקורטקס, שבוצע בימים עובריים 13.5, 14.5 ו-15.5. מוחות נאספו בשלב הפוסט-נטאל.יום שישי. שכבת התאי הקורטיקליים שעברו אלקטרופורציה שונה בבירור בכל ניסוי. הדבר מרמז כי אלקטרופורציה תלוית-זמן מאפשרת השגה ספציפית של תפקוד (gain of function) ואובדן תפקוד (loss of function) בשכבות קורטיקליות.כפי שמוצג כאן, אלקטרופורציה לרקמה עמוקה כגון התלמוס וההיפותלמוס. שימוש באלקטרודות פלטינה בצורת מוט מביא לעיתים ליעילות נמוכה, בעוד שימוש במיקרו-אלקטרודות לאלקטרופורציה מאפשר יעילות וחיוניות גבוהים יותר ברקמות עמוקות אלו.הזרקנו תמיסת פלסמיד DNA לתוך הגורה השלישית של עוברי עכבר. ביום עוברי 11.5, ביצענו אלקטרופורציה באמצעות מחט שהוגבלה לתלמוס; רוב האקסונים של התלמוס מקרינים אל קליפת המוח עד היום השישי לאחר הלידה. כאן אנו מציגים מיקרו-אלקטרופורציה של P-C-A-G-E-Y-F-P לתוך הראש המתפתח.אזור התלמוס מסומן על ידי RORC, המקשר את כל הנוירונים הפוסט-מיטוטיים בתלמוס. ניתן להדמיות גם את השליחות של האקסונים, המסומנות בחצים לבנים, אל שכבה ארבע של קליפת המוח באמצעות EYFP, הממלא את הנוירון כולו. מיקומה של שכבה ארבע בקליפת המוח מסומן אף הוא על ידי הנוגדן ל-RORC.ברגע ש-MA מתחיל, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 15 דקות לליטר אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לטפל במבחן בזהירות רבה כדי למנוע כל נזק בעקבות הפעולה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו שילוב כרומופור ספציפי ב-MDNA, כדי להבין את המנגנון המולקולרי של התמיינות תאים לאחר התפתחותם.טכניקה זו, tap wave, מאפשרת לחוקרים בתחום התפתחות מערכת העצבים המרכזית לחקור את המנגנונים המולקולריים של תבניתיות (patterning), צמיחה אקסונית ובניית מעגלים.

mouse-utero-electroporation-controlled-spatiotemporal-gene

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על...

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו...

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

מקור: Lutz, D., et al. הערכת פרמטרים של נוירופלסטיות אולטרה-מבנית לאחר התמרה ברחם של מוח העכבר וחוט השדרה המתפתחים. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים התמרה ויראלית באמצעות הזרקה תוך רחמית בעוברי עכברים. מכינים עכברה בהריון לניתוח, ומבצעים חתך בקו האמצע כדי לחשוף את קרני הרחם. תערובת של וירוס המכיל את הגן הרצוי וצבע מעקב מוזרקת לעוברים בתוך שקי הרחם במיקומים הממוקדים. לאחר מכן מחזירים את קרני הרחם לפני התפירה.

התמרה ויראלית ברחם בעכבר

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד להעביר באופן ספציפי אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית C57BL/6 באמצעות אלקטרופורציה ברחם. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לטרנספקציות של אזורים המתפתחים לקליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

כאן אנו מתארים שיטה ספציפית לזמן כדי לתפעל ביעילות מסלולים התפתחותיים קריטיים בשליית העכבר in vivo. זה מבוצע באמצעות הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידים CRISPR לתוך השליות של סכרים בהריון ביום העוברי 12.5.

עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

למדו שיטת אלקטרופורציה בתוך הרחם לשתילת גנים במוח העוברי של עכברים. טכניקה זו מאפשרת שליטה מרחבית וזמנית בזרימת DNA לשכבות קורטיקליות ומבנים עמוקים כמו התלמוס וההיפותלמוס.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

גלה סרטונים נוספים