עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג טרנספקציית גנים יעילה במערכת העצבים המרכזית של עוברי עכברים בנקודת זמן התפתחותית ובאזור מוחי רצויים. מטרה זו מושגת ראשית על ידי הכנת קפילריות מדויקות ואלקטרודות מסוג מחט כדי למנוע נזק לרחם. השלב השני של הפרוצדורה הוא למידת שיטת החזקה ייחודית של עוברי עכברים באמצעות כבל תאורה אופטי כדי להדמיות עוברי עכברים קטנים לצורך הזרקת DNA ממוקדת.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע אלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות מסוג מקל על פני השטח של הרחם, כדי להחדיר DNA לחלקים השטחיים של המוח; השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע אלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות מסוג מחט למבנים עמוקים יותר של המוח, כגון התלמוס וההיפותלמוס. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות טרנספקציה ספציפית של השכבה הקורטיקלית או טרנספקציה יעילה בתלמוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הזרקה רגילה במקום, הוא בנראות רבה יותר ובשליטה גבוהה יותר על אתר ההזרקה של העוברים ברחם.

אנו משתמשים בכבל דמוי סיב אופטי, המאפשר ויזואליזציה של עוברים החל מיום E 9.5 והחדרה של מחטים להעברת DNA פלסמידי לחלקים עמוקים יותר של המוח, כגון התלמוס וההיפותלמוס. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע למוח המתפתח, כגון בידול עצבי, דפוס התפתחות המוח וקישוריות עצבית. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקשיים, מכיוון שעיצוב המחט, האלקטרודה והשגת המיקום המדויק הן פעולות מורכבות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי לראות כיצד להכין אלקטרודות מחט מדויקות וכיצ nào למקם עוברים כדי לבצע אלקטרופורזה. זאת מכיוון ששני שלבים אלו הם המפתח להשגת תוצאות מוצלחות. להכנת קפילריים, השתמשו בשוב מחסנרי מיקרו-פיפט (micropipet puller) בהתאם להוראות היצרן.

בפרוצדורה זו, אנו משתמשים בצינורות קפילריים מזכוכית בקוטר מילימטר אחד ללא סיב פנימי. על מחטים משוכות להיות באורך של 800 מיקרומטר עד מילימטר מהקצה, עם קוטר חיצוני של פחות מ-60 מיקרומטר; השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה ובפינצטה כדי לקטוע את קצות המחטים לקוטר של 20 עד 30 מיקרומטר. מדדו כל מחט באמצעות מיקרומטר.

בשלב הבא, הכין מיקרו-אלקטרודות באמצעות ליפוף. יש ללפוף קצה אחד של תיל טונגסטן סביב פין מצופה זהב. השתמש בתיל טונגסטן עבור אלקטרודות שליליות ובתיל פלטינה עבור אלקטרודות חיוביות.

קבעו את התיל לפין באמצעות פאראם (param). לאחר מכן, הכניסו את התיל לתוך הגבעול הפלסטי של מקלון צמר גפן ועטפו את שני הקצוות ב-phim. שייפו באופן אחיד את קצה התיל בעזרת נייר זכוכית עדין עד שיגיע לעובי של 20 עד 30 micrometers בקצה, ו-60 micrometers במרחק של 800 micrometers עד מילימטר אחד מהקצה. בדקו שוב את הממדים הסופיים באמצעות מיקרומטר.

בשלב הבא, טבלו את התיל המחודד לתוך טיפה של לק ציפורניים כדי למרוח שכבה דקה על פני התיל כולו לצורך בידוד. לאחר שהלק התייבש, השתמשו במקלון צמר גפן ספוג באצטון כדי להסיר אותו מ-200 micrometers האחרונים של קצה המקל. אלקטרודות פלטינה נרכשות כשהן מוכנות ואינן דורשות הכנה.

בנוהל זה, אנו משתמשים ב-CUY six 10 P four dash one nepo gene electrode. טהרו את ה-DNA מהפלסמה באמצעות maxi prep או שיטה מקבילה, העבירו 100 micrograms של DNA למבחנה חדשה, והוסיפו 10 µL של צבע fast green בריכוז 1%. השתמשו ב-TE כדי להביא את הנפח ל-100 µL, עבור ריכוז סופי של 1 µg/µL של DNA מהפלסמה. ערבבו את התמיסה בעדינות באמצעות פיפטינג, ולאחר מכן סובבו את תמיסת ה-DNA במשך חמש דקות ב-14,000 RPM בטמפרטורת החדר כדי להסיר זיהומים ומלחים.

העבירו את ה-SNAT למבחנה חדשה. ניתן לשמור את תמיסת ה-DNA במבחנה בטמפרטורת החדר לאורך כל הפרוצדורה. לאחר מכן, חברו מחט משוכה למיקרו-מניפולטור בהתאם להוראות היצרן, ושקעו את קצה המחט בתוך תמיסת ה-DNA כדי למלא את המחט.

הניחי את המיקרו-מניפולטור בצד בזהירות והכיני את הציוד לפני הניתוח. שקלי עכברה ההרה בימי הריון 9.5 עד 15.5 כדי לקבוע את משקל הגוף.

לאחר מכן, הזרקה תוך-peritoneum. מזריקים sodium pentobarbital בדרגת תרופתית במינון של 50 micrograms לגרם משקל גוף וממתינים חמש דקות. חלופות ל-sodium pentobarbital עשויות לכלול ketamine, xylazine, הזרקה או חומרי הרדמה גזיים.

לאחר ההרדמה, השתמשו בתער וב-50% ethanol כדי לגגל את הפרווה מהבטן. הכינו את העור באמצעות קרצוף לסירוגין של Betadine ו-70% alcohol. בצעו חתך בקו האמצע של הבטן בעזרת מספריים עדינים.

הוציאו בזהירות את כל קרני הרחם על גבי גזה של כותנה לחה ב-PBS (מלחים פוספטיים מאוזני pH) המונחת סביב הפצע. שמרו על הרחם לח באמצעות PBS לאורך כל הזמן. השתמשו בכבל סיב אופטי גמיש.

הניחו את הכבל מתחת לקרן הרחם. מקמו את הרחם בין אור הסיב האופטי לבין האגודל ולחצו בעדינות כדי לדחוף את העובר כלפי מעלה, קרוב יותר לדופן הרחם. כאשר העובר ממוקם כך שהראש פונה שמאלה ולמעלה, הכניסו בזהירות את הנימיזיות הזכוכית אל תוך החדר המטרה והזריקו כ-1 µL של תמיסת DNA לאלקטרופורציה של שכבה 4 של קליפת המוח ביום עוברי 13.5.

הניחו את אלקטרודות הפלטינה בצורת מוט מחוץ לרחם והפעילו פולסי זרם של גל ריבועי חמש פעמים במתח של 38 volts למשך 50 milliseconds. במידה ומשתמשים באלקטרופורציה מיקרוסקופית כדי להגיע לתלמוס או להיפותלמוס ביום עוברי 10.5, הכניסו את אלקטרודת הטונגסטן השלילית הדקה אל תוך המערכה (ventricle) שבה הוזרק ה-DNA ואת אלקטרודת הפלטינה החיובית אל תוך הרחם. מקמו את אזור המטרה בין הקצוות של שתי האלקטרודות והפעילו את פולסי זרם הגל הריבועי המוצעים שלוש פעמים במתח של שבעה volts למשך 100 milliseconds.

לאחר השלמת האלקטרופורציה, החזירה את קרן הרחם למיקומה המקורי והוסף 500 µL של PBS. תפר את השכבה הפנימית של החתך באמצעות תפר כירורגי. לאחר מכן, סגור את השכבה החיצונית באמצעות אטוב-קליפ של תשעה מילימטרים.

הנח את העכבר על פד חימום למשך שעתיים כדי לאפשר התאוששות מהניתוח ומההרדמה. כאן מוצגת אלקטרופורציה של הפלטינום באזור הקורטקס, שבוצע בימים עובריים 13.5, 14.5 ו-15.5. מוחות נאספו בשלב הפוסט-נטאל.

יום שישי. שכבת התאי הקורטיקליים שעברו אלקטרופורציה שונה בבירור בכל ניסוי. הדבר מרמז כי אלקטרופורציה תלוית-זמן מאפשרת השגה ספציפית של תפקוד (gain of function) ואובדן תפקוד (loss of function) בשכבות קורטיקליות.

כפי שמוצג כאן, אלקטרופורציה לרקמה עמוקה כגון התלמוס וההיפותלמוס. שימוש באלקטרודות פלטינה בצורת מוט מביא לעיתים ליעילות נמוכה, בעוד שימוש במיקרו-אלקטרודות לאלקטרופורציה מאפשר יעילות וחיוניות גבוהים יותר ברקמות עמוקות אלו.

הזרקנו תמיסת פלסמיד DNA לתוך הגורה השלישית של עוברי עכבר. ביום עוברי 11.5, ביצענו אלקטרופורציה באמצעות מחט שהוגבלה לתלמוס; רוב האקסונים של התלמוס מקרינים אל קליפת המוח עד היום השישי לאחר הלידה. כאן אנו מציגים מיקרו-אלקטרופורציה של P-C-A-G-E-Y-F-P לתוך הראש המתפתח.

אזור התלמוס מסומן על ידי RORC, המקשר את כל הנוירונים הפוסט-מיטוטיים בתלמוס. ניתן להדמיות גם את השליחות של האקסונים, המסומנות בחצים לבנים, אל שכבה ארבע של קליפת המוח באמצעות EYFP, הממלא את הנוירון כולו. מיקומה של שכבה ארבע בקליפת המוח מסומן אף הוא על ידי הנוגדן ל-RORC.

ברגע ש-MA מתחיל, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 15 דקות לליטר אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לטפל במבחן בזהירות רבה כדי למנוע כל נזק בעקבות הפעולה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו שילוב כרומופור ספציפי ב-MDNA, כדי להבין את המנגנון המולקולרי של התמיינות תאים לאחר התפתחותם.

טכניקה זו, tap wave, מאפשרת לחוקרים בתחום התפתחות מערכת העצבים המרכזית לחקור את המנגנונים המולקולריים של תבניתיות (patterning), צמיחה אקסונית ובניית מעגלים.