בדיקת כימות זיהום חיידקי: שיטה לכימות עומס חיידקי תוך עיני במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקית

אנדופתלמיטיס חיידקית היא מחלת עיניים דלקתית המתרחשת כאשר Bacillus cereus - חיידק פתוגני - מדביק את האזור התוך עיני.

כדי לכמת את הזיהום החיידקי, הנח מודל עכבר שעבר המתת חסד של אנדופתלמיטיס חיידקית לרוחב על שולחן ניתוחים. יש להפעיל לחץ עדין מתחת לעין כדי לסייע בניתוק גלגל העין מהשקעה. העבירו את גלגל העין לתוך שפופרת המכילה חוצץ מתאים בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז.

הומוגניזציה של רקמת העין כדי לפרק אותה, לשחרר חיידקים בתרחיף. מעכבי הפרוטאז הקיימים במאגר משביתים את הפרוטאזות התאיות המשוחררות כדי לשמור על כדאיות החיידקים. לאחר מכן, יש לדלל באופן סדרתי את תרחיף החיידקים כדי לקבל ריכוזים שונים של Bacillus cereus.

קח צלחת תרבית זוויתית המכילה את מדיום האגר המועשר ותוחם שורות המתאימות לכל ריכוז דילול. יש להוציא כמה טיפות מהתרחיף החיידקי בחלק העליון של השורה המיועדת ולאפשר לו לזרום למטה עד שהוא מגיע לקצה הצלחת, מה שמסייע בהתפשטות אחידה של חיידקים. משטחים את הצלחת ודוגרים.

במהלך הדגירה, כל חיידק משתמש בחומרי המזון מהאגר כדי להתרבות וליצור מושבות בודדות. מספר המושבות פוחת, המקביל לעלייה בדילול התרחיף החיידקי. ספרו את מספר המושבות בשורה מסוימת כדי לכמת את עומס החיידקים בעין.

בנקודת הסיום הניסוי המתאימה, הוסיפו 400 מיקרוליטר של PBS בתוספת מעכב פרוטאז בצינור קציר אוטוקלאב אחד לכל עין על קרח, והניחו מלקחיים פתוחים ועדינים משני צידי העין הנגועה. יש לדחוף את הקצוות כלפי מטה לכיוון הראש כדי לחזק את העין.

ברגע שהמלקחיים נמצאים מאחורי כדור העין, לחץ את המלקחיים יחד ומשוך את המלקחיים הרחק מהראש כדי לנתק את גלגל העין. לאחר מכן, הנח מיד את גלגל העין לתוך צינור הקציר המסומן כראוי. תוך 60 דקות מאיסוף הדגימה, הנח את צינורות הקטיף הסגורים להומוגניזטור רקמות, והומוגניזציה של הדגימות לשתי תקופות הומוגניזציה של דקה אחת, עם תקופת מנוחה של 30 שניות ביניהן.

לאחר ההומוגניזציה, הניחו את הדגימות על קרח, והשתמשו בכמות של 20 מיקרוליטר של הומוגנאט כדי לדלל את הדגימות באופן סדרתי ב-180 מיקרוליטר PBS לכל דילול עד שמגיעים לפקטור של 1 כפול 10 עד שלילי 8. לאחר מכן, סמן כל שורה של צלחת BHI מרובעת מחוממת מראש עם ריכוז הדילול המתאים וכאשר הצלחת מוטה בזווית של 45 מעלות, הוסף 10 מיקרוליטר מכל דילול לשורות בודדות בחלק העליון של הצלחת. תן לכל דגימה לרוץ עד שהיא כמעט מגיעה לתחתית הצלחת לפני הנחת הצלחת שטוחה. לאחר שהדגימות נקלטו באגר, העבירו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. מושבות צריכות להתחיל להיראות לאחר שמונה שעות דגירה.

לייצוג מדויק של הריכוז בדגימה, ספרו את השורה שיש בה בין 10 ל-100 מושבות.