בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני מעין ארנב

תאי אפיתל פיגמנט הם תאים קובואידיים מובחנים סופיים המחוברים בצמתים הדוקים. תאי אפיתל אלה המרפדים את הקשתית הם תאי האפיתל של פיגמנט הקשתית או תאי IPE, ואלה הסמוכים לרשתית הם תאי האפיתל של פיגמנט הרשתית או תאי RPE.

כדי לחלץ את התאים הללו, קח עין ארנב שלמה. טפלו בעין בחומר חיטוי כדי להסיר מיקרואורגניזמים מפני השטח של העין. שוטפים את חומר החיטוי בתמיסת חיץ. בצע חתך ליד הקשתית. באמצעות פתח זה, בצע חתך מעגלי שלם לאורך גבול הקשתית, וחלק את העין למקטע קדמי המכיל קשתית וחלק אחורי המורכב מהרשתית והומור הזגוגית.

קח את הקטע הקדמי והשליך את העדשה כדי לגשת לקשתית. מוציאים את הקשתית ומניחים אותה על צלחת תרבות. לאחר מכן, קח את הקטע האחורי והשליך את הזגוגית הג'לטינית ואת הרשתית מהפקעת.

טפל בקשתית ובנורת העין עם טריפסין ודגירה. טריפסין משפיל את הצומת ההדוק ואת חלבוני המטריצה החוץ-תאיים, ויוזם דיסוציאציה של תאי אפיתל. זורקים את הטריפסין ומוסיפים מדיום תרבית מתאים. מגרדים בעדינות את הקשתית ואת משטח הנורה כדי לשחרר את תאי האפיתל במדיום.

לבסוף, זרעו את תאי ה-IPE וה-RPE בבארות נפרדות. התאים מוכנים לבדיקות נוספות במורד הזרם.

לאחר המתת חסד של החיה, השתמש במספריים מעוקלים ובמלקחיים של Colibri כדי להוציא את העיניים, ולאחר מכן נקה את רקמת השריר והעור שנותרו מהעיניים. אסוף את העיניים בצינור של 50 מיליליטר מלא ב-PBS לא סטרילי, והעביר את הצינור למכסה הזרימה הלמינרית. חטאו אותם על ידי טבילה בתמיסה על בסיס יוד למשך שתי דקות, ולאחר מכן העבירו את העיניים לצינור של 50 מיליליטר מלא ב-PBS סטרילי.

שים עין אחת על קומפרס גזה סטרילי, והחזק את העין בחוזקה קרוב לעצב הראייה, ואז חתוך קרוב לגבול הקשתית עם אזמל #11. בעזרת מספריים, חותכים סביב הקשתית, ומסירים את הקטע הקדמי, ומכניסים אותו לצלחת פטרי ומשאירים את הנורה עם הזגוגית, עד לבידוד אפיתל פיגמנט הרשתית, או תאי RPE.

כדי לבודד את תאי האפיתל של פיגמנט הקשתית, או תאי IPE, הסר את העדשה בעזרת מלקחיים עדינים, ושלף בעדינות את הקשתית המכילה את תאי ה-IPE. מניחים את האיריס בכלי פטרי, ושוטפים אותו עם PBS סטרילי. מוסיפים 500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין, ודוגרים במשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. מסירים את הטריפסין, מוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום שלם ומגרדים את ה- IPE בעדינות בעזרת פיפטה פסטר שטוחה מלוטשת באש.

אוספים את מתלה התאים ומכניסים אותו לצינור של 1.5 מיליליטר. ספרו את התאים באמצעות תא נויבאואר, וזרעו 0.2 מיליון תאים לבאר בצלחת של 24 בארות עם 1 מיליליטר של מדיום שלם. מניחים את הצלחת בחממה, ומגדלים אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.

כדי לבודד תאי RPE, הסר את הזגוגית והרשתית מהמקטע האחורי בעזרת מלקחיים דקים. הכניסו את הנורות לצלחת של 24 בארות, והוסיפו 500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין לעין, ודגרו במשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. הסר טריפסין, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום שלם לכל גלובוס, וגרד בעדינות את תאי ה- RPE בעזרת פיפטה פסטר מעוקלת מלוטשת באש.

אוספים את מתלה התאים ומכניסים אותו לצינור של 1.5 מיליליטר. ספרו את התאים באמצעות תא נויבאואר, וזרעו את התאים כפי שתואר קודם לכן. מניחים את הצלחת בחממה.