אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 4:11 דק׳ • July 8th, 2025
השכבה הפנימית ביותר של קרנית החזיר - חלק העין הקדמית השקוף של כלי הדם - מורכבת מתאי אנדותל קרנית, או CECs, הנתמכים על ידי קרום הבסיס - קרום Descemet, או DM. CECs שומרים על שקיפות הקרנית וראייה אופטימלית. כל נזק להם עלול להשפיע על הראייה.
לנזק סלקטיבי של CEC, התחל עם עין חזירית שזה עתה נקטפה במדיום מתאים. הסר את הרקמות שמסביב. טפל בעין בחומר חיטוי מתאים כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי על פני השטח. לאחר שטיפת מי מלח, בדוק אופטית את העין הקדמית כדי לשלול חריגות לפני הקרנת לייזר.
אבטח את העין במתקן אחיזה מותאם אישית מול יחידת מנורת חריץ המצוידת בלייזר באורך גל מסוים. דמיין את שכבות הקרנית הבודדות. עם אנרגיית לייזר מתאימה ומיקום נקודת מיקוד, כוון את פולסי הלייזר לשכבת האנדותל של הקרנית. הפולסים הממוקדים קצרי הטווח ובעלי ההספק הגבוה, גורמים לקרע סלקטיבי של CEC מהמשטח החשוף תוך הימנעות מפיזור חום, ובכך מגנים על רקמת ה-DM או הסטרומה.
יצירת פתח כניסה קרוב ללימבוס - הצומת הקרניאוסקלרי, הזרקת תמיסה ויסקו-אלסטית לתוך החדר הקדמי המכיל את הקרנית כדי לייצב אותה ולהגן על שאר ה-CECs. כרתו והעבירו את מקטע הקרנית שטופל בלייזר לתוך צלחת מרובת בארות המכילה מדיה, צד CEC פונה כלפי מעלה. ניתן להשתמש במודל הפגיעה באנדותל הקרנית ex vivo למחקרים נוספים.
לאחר השגת עיני חזיר טריות מבית המטבחיים המקומי, הניחו את הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס, בינוניות מלאה. השתמש במספריים כדי להסיר את הרקמות החוץ-תאיות, והשרו את העיניים בתמיסת עיניים של 5% פובידון-יוד למשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את הדגימות המחוטאות ב- PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
באמצעות מכשיר טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטרלי, סנן את העיניים לאיתור פתולוגיות עיקריות של המקטע הקדמי, כגון הצטלקות בקרנית, בצקת ואטימות אחרות. לאחר ההקרנה, מקם את העיניים מול יחידת מנורת חריץ המצוידת בלייזר Nd:YAG באורך גל של 1064 ננומטר, וקוטר נקודת מוקד של 10 מיקרומטר באוויר. בחרו בהגדלה של 12X והסיטו את התאורה כדי להמחיש את שכבות הקרנית הבודדות.
לאחר הגדרת אנרגיית הדופק ונקודת המיקוד לפרמטרים המתאימים לאבלציה סלקטיבית של תאי האנדותל בקרנית, יש למרוח מספר זריקות לייזר על הרקמה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, הניחו פרצנטזיס קרנית שקוף קרוב ללימבוס, והזריקו ויסקו-אלסטי כדי לייצב את החדר הפנימי. לאחר מכן, השתמש בטרפין של 8 מילימטר כדי לכרות את הקרנית המרכזית שטופלה בלייזר, והנח את הקרנית המבודדת לבאר אחת של צלחת בת 12 בארות, כשצד האנדותל כלפי מעלה. לאחר איסוף כל הקרניות, הוסיפו 3 מיליליטר של מדיום מלא לכל דגימה היטב, ודגרו על הדגימות עד שלושה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.