בידוד תאי אנדותל של אבי העורקים החזירי (pAEC): שיטה מבוססת אנזימים לבידוד תאי אנדותל מאבי העורקים הבטני של חזירים שנקטפו

אבי העורקים - העורק הראשי המוביל דם מחומצן מהלב לגוף - מורכב משלוש שכבות או 'טוניקות': אינטימה פנימית, מדיה אמצעית ואדוונטיציה חיצונית. תאי אנדותל או ECs נמצאים באינטימה כשכבה חד-שכבתית דקה ורציפה מעל קרום בסיס תומך המורכב מחלבונים מבניים, בעיקר קולגן.

כדי לבודד ECs, התחל עם אבי העורקים החזירי שנקטף בצלחת תרבית. כרתו את קצותיו ואת כל הרקמות הדבקות שמסביב כדי למנוע זיהום של תאים שאינם אנדותל. שטפו את אבי העורקים עם בופר המכיל אנטיביוטיקה כדי לעכב צמיחת חיידקים.

העבירו תפר כירורגי סטרילי דרך אבי העורקים וקשרו את אחד מקצותיו, תוך שמירה על התפר בתוך הלומן. אבטח את הקצה הקשור ומשוך את התפר כדי להפוך את אבי העורקים לחלוטין. זה חושף את האינטימה המכילה EC לעיכול אנזימטי. טפלו באבי העורקים בתמיסת קולגנאז מחוממת מראש בריכוז נמוך לפעילות אנזימים אופטימלית ודגירה.

קולגנאז מפרק את חלבוני הקולגן הקיימים בקרום הבסיס העומד בבסיס ה-ECs, ויוזם את הדיסוציאציה שלהם. לאחר הדגירה, יש להוסיף חוצץ מקורר כדי לנטרל את אנזימי הקולגנאז.

מגרדים בעדינות את המשטח האינטימי של אבי העורקים ושוטפים אותו עם חיץ כדי לשחרר את ה-ECs לתמיסה. צנטריפוגה את הפתרון הזה כדי לגלול את ה-ECs. השעו מחדש את הגלולה במדיום מתאים. זרע את תרחיף התאים בבקבוק תרבית ודגירה. ה-ECs נצמדים לתחתית הבקבוק ומתרבים.

לבידוד תאי אנדותל אבי העורקים החזירי, העבירו את אבי העורקים החזיר לצלחת פטרי בגודל 150 מילימטר בתנאים אספטיים, והסירו בעדינות את שני קצוות הכלי. חתוך כל רקמה עודפת נוספת במקום שבו הכלי היה מהודק, בעזרת מלקחיים ומספריים סטריליים, והשתמש ב-20 עד 50 מיליליטר של מאגר כביסה טרי כדי לשטוף את החלק החיצוני והפנימי של אבי העורקים.

לאחר מכן, העבירו תפר כירורגי דרך אבי העורקים, וקשרו באופן רופף קצה אחד של הכלי, תוך שמירה על התפר בתוך הלומן. קבע בעדינות את אבי העורקים ליד הקצה הקשור בעזרת מלקחיים, ולאחר מכן משוך את התפרים הניתוחיים באיטיות כדי להפוך את אבי העורקים עד שמשטח האנדותל של אבי העורקים נחשף.

שטפו את פני האנדותל של אבי העורקים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של מאגר כביסה טרי לכל שטיפה והניחו את אבי העורקים בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. מכסים את הדגימה ב-10 מיליליטר של תמיסת עיכול 0.005% קולגנאז IV מחוממת ב-37 מעלות צלזיוס, ודוגרים על הרקמה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

בתום הדגירה, העבירו את כל תכולת הצינור לכלי תרבית של 100 מילימטר ועצרו את העיכול עם 10 עד 15 מיליליטר של מאגר עצירה מקורר מראש. בעזרת מגרד תאים, הסר בעדינות את תאי האנדותל של אבי העורקים מהמשטח הפנימי של הכלי, ושטוף את הכלי שלוש פעמים עם 5 מיליליטר של מאגר כביסה לכל שטיפה.

לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר, ושטפו את תחתית צלחת התרבות פעמיים עם 5 מיליליטר מאגר כביסה טרי לכל שטיפה, ואגדו את השטיפות בצינור 50 מילימטר.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשליך את כל 10 המיליליטר האחרונים של סופרנטנט. הוסף 20 מיליליטר של מאגר כביסה כדי להשעות מחדש את הכדורים, תוך הקפדה על הימנעות מבועות, ואסוף את התאים עם צנטריפוגה נוספת.

השעו מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר של מדיום תרבית תאים לספירה, וצלחו את התאים ב-1 x 10 ל-6 תאים לריכוז בקבוק של 25 סנטימטרים בריבוע. לאחר מכן, הניחו את התאים בחממת תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, ורעננו את המדיום כל יומיים עד שלושה.