אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 3:15 דק׳ • July 8th, 2025
ויטריפיקציה של עוברים היא טכניקת שימור בהקפאה מהירה במיוחד המקררת עוברים בקצב מהיר במיוחד לטמפרטורות נמוכות במיוחד, מה שמקל על אחסונם לטווח ארוך.
כדי להתחיל, קח עוברי ארנב שנקטפו במדיה מתאימה. דגרו את העוברים בתמיסה מאזנת המכילה ריכוזים נמוכים של חומרים קריופרוטקטנטים חודרים לתאים - אתילן גליקול, או EG, ודימתיל סולפוקסיד, או DMSO. EG ו-DMSO מתפזרים דרך קרומי התאים, מחליפים מולקולות מים בתוך התאים ומונעים היווצרות גבישי קרח תוך תאיים.
לאחר מכן, דגרו על העוברים בתמיסת ויטריפיקציה המכילה ריכוזים גבוהים יותר של EG ו-DMSO כדי לאפשר חדירה נאותה של חומרי ההקפאה ופליטת מים תוך תאית מספקת, ולהגן על התאים מפני נזקי הקפאה.
חבר מנשא קש קריוגני סטרילי למיקרו-דיספנסר. בעזרת המיקרו-מתקן, מלאו את הקשית במדיה הרצויה לרמה המתאימה. לאחר מכן, שאפו בועת אוויר, ואחריה נפח מינימלי של תמיסת ויטריפיקציה המכילה עובר, ובועת אוויר נוספת.
שאפו שוב את המדיה עד שחלק המדיה הראשון פשוט מרטיב ומפלמר את פקק הכותנה המצופה באבקה, ואוטם את קצה הקש. סגור את הקצה השני עם פקק קש הידרופובי. מקטעי האוויר והמדיה עוזרים לבודד עוברים בתוך הנשא הסגור.
טבלו בקצרה את הקש בחנקן נוזלי בטמפרטורה של -196 מעלות צלזיוס. הנשא מבטיח שיעורי קירור גבוהים, ממצק עוברים לפאזה אמורפית דמוית זכוכית, בעוד שהנפח הנמוך של תמיסת הזיגוג וחומרי ההקפאה המשמשים מפחיתים את הלחץ האוסמוטי. ניתן לאחסן את העוברים המזוגגים, עם פעילות מטבולית מושעית, עד לשימוש.
לזיגוג עוברי, טבלו את העוברים בתמיסה מאזנת למשך 2 דקות, ולאחר מכן דגירה של דקה בתמיסת ויטריפיקציה. בתום הדגירה, העמיסו את העוברים למיני-קש פלסטיק של 125 מיקרוליטר, וחברו את הקצה הסגור של הקש עם מיקרו-דיספנסר מתאים של 1 מיליליטר. שאפו בסיס בינוני עד שליש מאורך הקש, ואחריו בועת אוויר קטנה.
לאחר מכן, השתמש בסטריאומיקרוסקופ כדי לשאוב את העוברים ב-40 מיקרוליטר של תמיסת ויטריפיקציה, ואחריה בועת אוויר קטנה נוספת במדיום בסיס מספיק כדי להעביר את החלק הנוזלי הראשון עד לקצה הכותנה של המיני-קש. לאחר מכן, סגור את הקצה הפתוח של המיני-קש עם פקק קש, צלל את המיני-קש ישירות לתוך חנקן נוזלי כדי להשיג זיגוג, ואחסן את המיני-קש בדיואר חנקן נוזלי.